Development and Optimization of Human iPSC-Derived Mammary Gland Organoids as an In Vitro Platform for Breast Cancer Research

The human mammary gland is organized into luminal alveolar and baso-myoepithelial cell compartments embedded within a stromal microenvironment critical for glandular development and homeostasis. Breast cancer — the most common malignancy in women worldwide — frequently arises from disruptions in this cellular organization, with germline BRCA1/2 mutations conferring significantly elevated oncogenic risk. Physiologically relevant in vitro models recapitulating mammary architecture are therefore of paramount scientific and clinical importance. This study presents an optimized multi-step protocol for generating three-dimensional (3D) mammary-like organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs), derived from both healthy female donors and individuals carrying BRCA1/2 mutations. iPSCs were aggregated into mammary embryoid bodies (mEBs) using MammoCult medium supplemented with hydrocortisone and heparin to promote non-neural ectodermal specification. Mammary commitment was induced with parathyroid hormone-related protein (PTHrP), followed by embedding of 10-day mEBs in a Matrigel/Collagen I composite matrix enriched with FGF10 and HGF to drive branching morphogenesis and alveolar differentiation. Structurally organized organoids were consistently obtained by day 30. Molecular and histological characterization confirmed successful mammary fate acquisition. Quantitative RT-PCR and immunohistochemical analyses demonstrated progressive downregulation of pluripotency markers (OCT4, NANOG, KLF4) alongside upregulation of luminal markers (GATA3, CK18) and basal/myoepithelial markers (TP63, CK5/6, CK14, SMA), reproducing the characteristic bilayered architecture of the native gland. Residual expression of neural ectoderm markers PAX6 and FOXG1 was also detected, indicating persistent cellular heterogeneity that remains a challenge for further protocol optimization. A central finding concerns the dynamic regulation of steroid hormone receptors throughout organoid development. Consistent with the established constitutive expression of the progesterone receptor (PR) in iPSCs following somatic reprogramming — independent of cell of origin or reprogramming method, and in the absence of estrogen receptor alpha (ERα) — PR was transiently downregulated during the early mEB phase and subsequently restored in mature 20-day organoids, mirroring its physiological regulation during mammary morphogenesis. The concomitant expression of PR and GATA3 in mature organoids reflects a functional regulatory axis critical to luminal differentiation and frequently dysregulated in breast cancer. ERα was not detected, consistent with its known downregulation in actively proliferating mammary epithelium. These receptor dynamics are particularly relevant for modeling BRCA1/2-mutant contexts, in which hormone receptor signaling is commonly disrupted. Collectively, this work establishes iPSC-derived 3D mammary organoids as a robust and reproducible platform faithfully recapitulating the morphological organization, lineage composition, and partial functional properties of human mammary tissue. Future directions include optimizing the stromal microenvironment, reducing residual neural subpopulations, extending differentiation toward a fully secretory phenotype, and integrating CRISPR-based gene editing to model BRCA1/2 mutation effects in a patient-specific context. This system holds significant translational potential for breast cancer research, drug screening, and personalized oncological medicine.

La ghiandola mammaria umana è un organo complesso e responsivo agli ormoni, il cui epitelio è organizzato in cellule luminali alveolari, deputate alla secrezione lattea, e cellule baso-mioepiteliali, che forniscono supporto strutturale. Questi compartimenti sono immersi in un microambiente stromale cruciale per lo sviluppo e l'omeostasi ghiandolare. Il carcinoma mammario, la neoplasia più frequente nella popolazione femminile mondiale, insorge spesso da alterazioni di questa organizzazione cellulare; in tale contesto, le mutazioni germinali in BRCA1 e BRCA2 conferiscono un rischio oncogeno significativamente elevato. Lo sviluppo di modelli umani in vitro fisiologicamente rilevanti, capaci di ricapitolare l'architettura del tessuto mammario, riveste pertanto una fondamentale importanza scientifica e clinica. Per superare i limiti dei sistemi di coltura bidimensionali convenzionali, questo studio presenta un protocollo multi-step ottimizzato per la generazione di organoidi tridimensionali simil-mammari da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) umane, derivate sia da donatrici sane sia da individui portatori di mutazioni BRCA1/2. Le iPSC sono state aggregate in corpi embrioidi mammari (mEB) con terreno MammoCult integrato con idrocortisone ed eparina, per promuovere la specificazione verso l'ectoderma non neurale. L'impegno verso il lineaggio mammario è stato indotto mediante la proteina correlata all'ormone paratiroideo (PTHrP); i mEB al decimo giorno sono stati inclusi in una matrice composita di Matrigel e Collagene I arricchita con FGF10 e HGF per guidare la morfogenesi ramificata e il differenziamento alveolare. Organoidi strutturalmente organizzati sono stati ottenuti in modo riproducibile entro il trentesimo giorno di differenziamento. La caratterizzazione molecolare e istologica ha confermato l'acquisizione del destino cellulare mammario. Le analisi di RT-PCR quantitativa e immunoistochimica hanno evidenziato una progressiva riduzione dei marcatori di pluripotenza (OCT4, NANOG, KLF4) e un concomitante aumento dei marcatori luminali (GATA3, CK18) e basali/mioepiteliali (TP63, CK5/6, CK14, SMA), riproducendo la caratteristica architettura a doppio strato della ghiandola nativa. È stata inoltre rilevata un'espressione residua dei marcatori dell'ectoderma neurale PAX6 e FOXG1, indice di una persistente eterogeneità cellulare che rappresenta una sfida per l'ottimizzazione futura del protocollo. Un risultato fondamentale riguarda la regolazione dinamica dei recettori degli ormoni steroidei durante lo sviluppo degli organoidi. In linea con la recente dimostrazione che il recettore del progesterone (PR) è espresso costitutivamente nelle iPSC dopo riprogrammazione somatica — indipendentemente dalla cellula di origine o dal metodo impiegato, e in assenza del recettore alfa degli estrogeni (ERα) — questo studio ha monitorato longitudinalmente l'espressione di PR nelle diverse fasi di differenziamento. Il PR è stato transitoriamente down-regolato nella fase iniziale dei mEB e successivamente ripristinato negli organoidi maturi a 20 giorni, rispecchiando la sua regolazione fisiologica durante la morfogenesi mammaria. La concomitante espressione di PR e GATA3 negli organoidi maturi riflette un asse regolatorio cruciale per il differenziamento luminale e frequentemente alterato nel carcinoma mammario. ERα non è stato rilevato, in accordo con la sua nota riduzione nell'epitelio mammario in attiva proliferazione. Tali dinamiche recettoriali sono particolarmente rilevanti per modellare i contesti con mutazioni BRCA1/2, nei quali il signaling dei recettori ormonali è comunemente compromesso. Nel complesso, questo lavoro stabilisce che gli organoidi mammari 3D derivati da iPSC costituiscono una piattaforma robusta e riproducibile, in grado di ricapitolare fedelmente l'organizzazione morfologica, la composizione dei lineaggi cellulari e parziali proprietà funzionali del tessuto mammario umano.