iPSC-based platforms for exploring the effects and mechanisms of exogenous electrical stimulation in dopaminergic neurons and generating personalized in vitro models of neurodegenerative and psychiatric disorders.

Nowadays, approximately 40% of the global population is affected by neurological and neurodegenerative disorders, while around 12/13% are present with neuropsychiatric conditions. Pharmacological treatments are the primary intervention for both the management of neurodegenerative and neuropsychiatric disorders; however, they are often associated with negative side effects as well as decreased in effectiveness over time. Recent alternative nonpharmacological therapeutic strategies, such as deep brain stimulation and transcranial magnetic stimulation, have gained increased interest. However, the application of these alternative technologies reports inconsistent clinical results often correlated with the clinical trial design but also to the limited knowledge about their mechanisms of action. Over the years, several animal models have been developed to further understand the cellular and molecular mechanisms underlying diseases and to evaluate pharmacological treatments. However, animal models display some limitations related to the genetic, anatomical, and physiological differences between animals and humans. The introduction of the induced pluripotent stem cells (iPSCs) technology has enabled the derivation of patient-specific pluripotent cells, providing valid support to model human disease, identify novel therapeutic strategies, and study their mechanisms of action. The first aim of this thesis is to study the molecular and cellular mechanisms mediated by exogenous electrical stimulation (EES) in a human in vitro model of midbrain dopaminergic (mDA) neurons derived from iPSCs. The results highlight that EES induces a significant dosedependent neural plasticity effect in mDA neurons, modifying. In addition, the analysis of molecular and cellular mechanisms shows that EES promotes neuronal plasticity through a coordinated mechanism involving various membrane and intracellular effectors. In particular, EES increases intracellular calcium levels by acting on voltage-dependent membrane channels, activates intracellular pathways, and modulates D3 receptor activity. Overall, these findings advance our comprehension of the mechanisms of action and neuronal effects elicited by EES. The second aim of this work is to establish two iPSC-based disease models of neurodegenerative and neuropsychiatric disorders, to investigate the effects of EES under pathological conditions. First of all, the results confirm the generation of iPSCs from three subjects affected by multiple system atrophy (MSA), a rare neurodegenerative disease that currently has limited therapeutic options. Furthermore, the differentiation of iPSCs into mDA neurons, which are involved in pathology, is confirmed by the expression of mDA markers associated with development and maturation. Subsequent morphological analysis of mDA neurons derived from patients affected by MSA and two healthy subjects demonstrated the presence of alterations in the dendritic arborization in MSA patients, confirming the presence of a pathological phenotype. In addition, iPSCs, previously generated in our laboratory, of healthy controls and patients with major depressive disorder (MDD) are differentiated into guided cortical organoids (gCOs). Gene expression analysis of early and late cortical patterning markers confirms the appropriate progression of growth and differentiation. High-density microelectrode array technology is applied to study electrophysiological properties of gCOs, suggesting a functional deficit in electrical activity of gCOs derived from iPSCs of MDD patients. These results demonstrate the development of two in vitro models for investigating the effects of EES in neurodegenerative and neuropsychiatric disorders.

Al giorno d’oggi, circa il 40% della popolazione mondiale soffre di malattie neurologiche e neurodegenerative, mentre il 12/13% convive con disturbi mentali e problemi psichiatrici. Le terapie farmacologiche rappresentano la prima linea d’intervento per queste condizioni; tuttavia, in alcuni casi risultano inefficaci e accompagnate da effetti collaterali. Per questo motivo, la ricerca si sta spingendo verso lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche non farmacologiche basate sull’applicazioni di campi elettromagnetici come la stimolazione cerebrale profonda o la stimolazione magnetica transcranica. Tuttavia, i risultati clinici di queste strategie alternative sono inconsistenti. L’introduzione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ha permesso di generare cellule specifiche per i singoli pazienti e di creare modelli in vitro delle patologie umane, facilitando lo studio dei meccanismi molecolari delle malattie e di nuovi approcci terapeutici. Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è stato lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari attivati dalla stimolazione elettrica esogena (EES) in un modello umano di neuroni dopaminergici mesencefalici (mDA) derivati da iPSCs. I risultati hanno dimostrato che la EES induce un effetto di plasticità neuronale dose-dipendente nei neuroni mDA derivati da iPSCs. L’analisi dei meccanismi molecolari e cellulari ha mostra che la EES promuove l’effetto di plasticità neuronale mediante un meccanismo coordinato che coinvolge vari effettori di membrana e intracellulari. In particolare, la EES aumenta i livelli di calcio intracellulare agendo sui canali di membrana voltaggio-dipendenti, attiva pathways intracellulari e modula l’attività del recettore D3 della dopamina. Complessivamente, questi risultati ampliano la nostra comprensione dei meccanismi d’azione e degli effetti neuronali della EES. Il secondo obiettivo di questo lavoro è lo sviluppo di due modelli in vitro, derivati da iPSCs, per malattie neurodegenerative e neuropsichiatriche, con l’obiettivo di studiare gli effetti della EES in condizioni patologiche. In primo luogo, i risultati riportati in questo lavoro hanno confermato la generazione di iPSCs da tre soggetti affetti da atrofia multisistemica, una malattia neurodegenerativa rara che attualmente ha opzioni terapeutiche limitate. Inoltre, l’analisi dell’espressione genica di marcatori dopaminergici associati allo sviluppo e alla maturazione ha dimostrato la corretta differenziazione delle iPSCs in neuroni mDA. La successiva analisi morfologica dei neuroni mDA derivati dai pazienti affetti da MSA e da due soggetti sani ha mostrato la presenza di alterazioni dell’albero dendritico nei pazienti, confermando la presenza di un fenotipo patologico. In secondo luogo, è stato generato un modello in vitro per il disturbo depressivo maggiore (MDD). Le iPSCs di due soggetti affetti da MDD e di un soggetto sano, precedentemente generate e caratterizzate nel nostro laboratorio, sono state differenziate in organoidi corticali guidati (gCOs). La corretta crescita e maturazione dei gCOs è stata confermata attraverso l’analisi dell’espressione genica di marcatori corticali. La tecnologia dei microelectrode array ad alta densità è stata utilizzata per studiare le proprietà elettrofisiologiche dei gCOs derivati dalle iPSCs del soggetto sano e dei pazienti affetti da MDD, suggerendo un deficit funzionale nell’attività elettrica nei gCOs derivati da iPSCs dei pazienti rispetto ai gCOs del controllo. Questi risultati hanno dimostrano lo sviluppo di due modelli in vitro che potranno essere utilizzati in futuro per studiare gli effetti della EES nel contesto di una malattia neurodegenerativa e una condizione neuropsichiatrica.