Looking beyond the NF1 and NF2 genes: identification of additional players contributing to phenotypic severity and variability in NF1 and NF2 microdeletion patients

Neurofibromatosis type 1 (NF1) and Neurofibromatosis type 2 (NF2) are rare autosomal dominant disorders primarily caused by point mutations or small insertions/deletions in the NF1 and NF2 genes, respectively. Both syndromes are multisystemic and characterized by a predisposition to tumor development. In rare cases, patients present with microdeletions encompassing not only the causative gene but also flanking genes, often resulting in a more severe and variable phenotype. These observations indicate that the pathogenesis of both syndromes extends beyond the mere NF1 or NF2 gene haploinsufficiency. NF1 microdeletions, classified as typical or atypical based on breakpoint location, have been extensively characterized in terms of gene content and possible genotype-phenotype correlations. However, these correlations alone do not fully explain the clinical complexity observed in affected individuals. NF2 microdeletions are even rarer, highly heterogeneous, and poorly described due to the absence of recurrent breakpoints; therefore, their underlying pathogenic mechanisms remain largely unexplored. The aim of this research project was to investigate multiple pathogenic mechanisms contributing to the complex phenotypes observed in patients with NF1 and NF2 microdeletions. Regarding NF1, a potential dysfunction of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), which includes SUZ12, one of the genes commonly deleted in NF1 microdeletions, was investigated. Altered expression of PRC2 core components and target genes was detected by qPCR assays in patients with both NF1 microdeletions and intragenic mutations. This dysregulation is likely driven by Ras pathway hyperactivation and may contribute to the tumorigenic phenotype characteristic of these individuals. To provide a platform for future molecular and functional analyses, induced pluripotent stem cell (iPSC) lines were generated from two patients carrying the typical type-1 NF1 deletion and an atypical NF1 deletion. Regarding NF2, the extent of two novel 22q12.1-q12.2 microdeletions was characterized by array-CGH. To define the deletion breakpoints at the single-base resolution, the Long-Read Sequencing (LRS) was carried out. The deletions, encompassing 3.1 and 2.4 Mb, include 44 and 47 protein-coding genes, respectively, and display breakpoints located within repetitive sequences of low mutual homology. These findings suggest that both rearrangements were likely generated through non-homologous end joining (NHEJ) or microhomology-mediated end joining (MMEJ) repair mechanisms. Analysis of the topological and regulatory architecture of the 22q12 region revealed predicted alterations in the 3D chromatin organization and regulatory interactions following NF2 deletions. These changes were consistent with a position effect impacting the expression of several flanking genes, a finding further confirmed by qPCR analyses. LRS also enabled the detection of additional variants and CNVs, enhancing the molecular characterization of both patients. We proposed a potential correlation between the loss of one allele of AP1B1 and cognitive impairment, as well as between a pathogenic variant in the modifier gene EVC and the cardiac defects observed in the corresponding patient. Overall, the findings suggest that disease phenotypes may result not only from the loss of deleted genes but also from the dysregulation of flanking genes and the influence of variants in modifier genes. This study represents a pilot investigation that opens new perspectives in the understanding of pathogenic mechanisms underlying microdeletion syndromes. The results presented here have potential implications for the diagnosis, prognosis, and clinical management of patients carrying NF1 and NF2 microdeletions and may guide the identification of novel therapeutic targets for the development of personalized pharmacological treatments.

La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) e la Neurofibromatosi di tipo 2 (NF2) sono malattie rare a trasmissione autosomica dominante, causate principalmente da mutazioni puntiformi o da piccole inserzioni/delezioni, rispettivamente nei geni NF1 e NF2. Entrambe le sindromi predispongono allo sviluppo di tumori. Più raramente, i pazienti presentano microdelezioni che coinvolgono non solo il gene causativo, ma anche geni fiancheggianti, con conseguente fenotipo più severo. Tali osservazioni indicano che la patogenesi delle Neurofibromatosi va oltre la semplice aploinsufficienza dei geni NF1 o NF2. Le microdelezioni NF1 sono state caratterizzate in termini di contenuto genico e di possibili correlazioni genotipo-fenotipo, che non spiegano del tutto la complessità clinica osservata nei soggetti affetti. Le microdelezioni NF2 sono ancora più rare, altamente eterogenee e poco descritte per l’assenza di breakpoint ricorrenti, per cui i loro meccanismi patogenetici rimangono in gran parte inesplorati. L’obiettivo del progetto è stato indagare i meccanismi patogenetici che contribuiscono ai fenotipi complessi dei pazienti con microdelezioni NF1 e NF2. Per la NF1, è stata analizzata una possibile disfunzione del Complesso PRC2, che include SUZ12, uno dei geni comunemente inclusi nelle microdelezioni NF1. L’espressione alterata delle subunità principali e di geni target di PRC2 è stata rilevata con saggi di qPCR in pazienti con microdelezioni e con mutazioni intrageniche del gene NF1. Questa disregolazione, probabilmente indotta dall’iperattivazione del pathway di Ras, potrebbe contribuire al fenotipo tumorale caratteristico di questi individui. Al fine di fornire un modello per future analisi molecolari e funzionali, sono state generate linee di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da due pazienti, uno con la tipica delezione NF1 di tipo 1 e uno con una delezione NF1 atipica. Per la NF2, l’estensione di due nuove microdelezioni 22q12.1-q12.2 è stata caratterizzata mediante array-CGH. Per definire i breakpoint a livello di singola base, è stato eseguito il Long-Read Sequencing (LRS). Le delezioni, di 3,1 e 2,4 Mb, comprendono rispettivamente 44 e 47 geni e presentano breakpoint localizzati in sequenze ripetute a bassa omologia reciproca. Questi risultati suggeriscono che entrambi i riarrangiamenti siano stati generati tramite meccanismi di riparazione del DNA. L’analisi dell’architettura topologica e regolatoria della regione 22q12 ha portato a predire alterazioni nell’organizzazione tridimensionale della cromatina e nelle interazioni regolatorie a seguito delle delezioni NF2. Tali modifiche delle interazioni DNA-DNA risultano coerenti con un effetto posizione che influenza l’espressione di diversi geni adiacenti, dato ulteriormente confermato da saggi di qPCR. Il LRS ha inoltre permesso di rilevare ulteriori varianti e CNV, migliorando la caratterizzazione molecolare di entrambi i pazienti. È stata proposta una potenziale correlazione tra la perdita di un allele di AP1B1 e il deficit cognitivo, nonché tra una variante patogenetica nel gene modificatore EVC e le anomalie cardiache osservate nel paziente portatore della variante stessa. I risultati suggeriscono che i fenotipi patologici possano derivare non solo dalla perdita dei geni deleti, ma anche dalla disregolazione dei geni fiancheggianti la delezione e dal contributo di varianti in geni modificatori. Questo studio pilota apre nuove prospettive nella comprensione dei meccanismi patogenetici alla base delle sindromi da microdelezione. I risultati presentati hanno potenziali implicazioni per la diagnosi, la prognosi e la gestione dei pazienti portatori di microdelezioni NF1 e NF2 e potrebbero guidare l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per lo sviluppo di trattamenti personalizzati