THE MOLECULAR CHARACTERISATION OF ESBL AND CARBAPENEMASE-PRODUCING ESCHERICHIA COLI FROM WASTEWATER, FRESHWATER AND FARM MANURE

Antimicrobial resistance (AMR) is one health issue driven by interlinked environments, animals and human interfaces and helping in the dissemination of virulence and mobile genetic element-encoding resistance genes across different settings. Our primary objective was to determine associations of season, source and rain on bacterial resistance among Escherichia coli isolates from the Mella River, wastewater treatment plant and bovine and swine farms. For this purpose, we collected wastewater (n = 42), animal farm manure (n = 36), and freshwater sources (n = 78) within the same geographic location during spring 2023 and autumn 2025 from Brescia, Italy. In this study, the identification of bacterial species was carried out through phylogenetic analysis and colony morphology. The antimicrobial susceptibility testing was performed phenotypically after confirming the ESBL and carbapenemase genes with polymerase chain reaction. Additionally, positive carbapenemase- and ESBL-encoding E. coli isolates were subjected to whole genome sequencing for further analysis of resistance mechanisms. We identified that ESBL prevalence was non-significantly different across all the sources, including wastewater (22%), followed by freshwater (26%) and the highest in manure (33%), respectively. In contrast, carbapenemase-producing E. coli was significant (59%) in wastewater and swine (59%). While there was a non-significant difference among the three different sampling points on the river. We observed the significant association of carbapenem-resistant E. coli with the autumn season. Similarly, sources from wastewater and swine samples' phylogenetic structuring presented the predominance of A, B1 and B2 from wastewater samples, where C, D and F phylogroups were prevalent in the freshwater and farm manure. The blaCTM-1 and blaTEM-1B were the most common resistant genes detected from ESBL-encoding resistant E. coli isolates from both autumn and spring samplings. The commonly detected carbapenemase-resistant gene was blaOXA. The bioinformatic analysis of five long-read sequencing data revealed the presence of broader diversity in the MLST types among all the 4 sources, while ST46, ST88, ST167 and ST410 among all the 5 isolates. More specifically, ESBL-resistant E. coli isolates were carrying the blaTEM-1B, blaCTX-M-1, blaCTX-M-15, blaCMY-2 and blaCMY-42 genes. Carbapenemase-resistant genes were blaOXA-1, blaOXA-181 and blaNDM-5 identified from wastewater sources. While plasmid IncF1B, IncI1, IncI-γ/K1, IncFIA, IncFIC, IncFII, IncFIC and rep_cluster_2350 replicons were identified from various sequenced isolates, highlighting the role of horizontal gene transfer, particularly in the ESBL-resistant bacteria. Our study highlights resistance mediated by the shared determinants of ARGs associating reservoirs, although there was diversity in the AMR among all the interfaces, where wastewater and swine were presenting higher resistance. Thus, continuous surveillance at the genomic level is vital, along with updating the strategies and policies on antimicrobial stewardship and mitigation of AMR threat. Keywords: Escherichia coli, phylogroups, freshwater, wastewater, bovine, swine, ESBL and carbapenemase resistance, MIC, whole genome sequencing (WGS).

La resistenza antimicrobica (AMR) è un problema di One Health guidato dalle interfacce interconnesse tra ambiente, animali e esseri umani, che facilitano la diffusione di fattori di virulenza ed elementi genetici mobili portatori di geni di resistenza antimicrobica in diversi contesti. L'obiettivo principale di questo studio era quello di indagare le associazioni tra stagione, fonte e precipitazioni con la resistenza batterica in isolati di Escherichia coli ottenuti dal fiume Mella, da un impianto di trattamento delle acque reflue e da allevamenti bovini e suini. A tal fine, sono stati raccolti campioni di acque reflue (n = 42), letame animale (n = 36) e acqua dolce (n = 78) dalla stessa area geografica durante la primavera del 2023 e l'autunno del 2025 a Brescia. L'identificazione batterica è stata effettuata mediante analisi filogenetica e morfologia delle colonie. I test di sensibilità antimicrobica sono stati condotti fenotipicamente dopo la conferma dei geni ESBL e carbapenemasi mediante reazione di amplificazione a catena della polimerasi (PCR). Inoltre, isolati selezionati di Escherichia coli produttori di ESBL e carbapenemasi sono stati sottoposti a sequenziamento dell'intero genoma per caratterizzare ulteriormente i meccanismi di resistenza. I risultati hanno mostrato che la prevalenza di ESBL non differiva significativamente tra le fonti, con valori del 22% nelle acque reflue, del 26% nelle acque dolci e del 33% nel letame animale. Al contrario, gli E. coli produttori di carbapenemasi erano più prevalenti in modo significativo nelle acque reflue (59%) e negli isolati suini (59%). Non sono state osservate differenze significative tra i tre punti di campionamento lungo il fiume. È stata osservata una significativa associazione tra E. coli produttori di carbapenemasi e la stagione autunnale. L'analisi filogenetica ha rivelato una predominanza dei gruppi A, B1 e B2 nei campioni di acque reflue, mentre i gruppi C, D e F erano più comuni nelle acque dolci e nel letame animale. I geni ESBL più frequentemente rilevati erano blaCTX-M e blaTEM, identificati in entrambi i periodi di campionamento primaverile e autunnale. Il gene della carbapenemasi rilevato più frequentemente è stato blaOXA. L'analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento a lunga lettura ha rivelato una notevole diversità nella tipizzazione multilocus sequence typing (MLST), inclusi i tipi di sequenza ST410, ST167, ST515, ST131, ST88, ST58 e ST10 e altri, tra gli isolati selezionati. Gli isolati produttori di ESBL presentavano geni come blaTEM-1B, blaTEM-1A, blaCTX-M-1, blaCTX-M-15, blaCMY-2 e blaCMY-42, mentre i geni della carbapenemasi (blaOXA-1, blaOXA-181 e blaNDM-5) sono stati identificati principalmente negli isolati derivati dalle acque reflue. Sono stati rilevati repliconi plasmidici, tra cui IncF1B, IncI1, IncFIA, IncFIC, IncI-γ/K1, IncX1, IncY, IncFII e rep_cluster_2350, in diversi isolati, suggerendo un ruolo del trasferimento genico orizzontale nella diffusione dei geni di resistenza. Nel complesso, questo studio evidenzia la diversità della resistenza antimicrobica nelle interfacce ambientali e agricole, con gli impianti di trattamento delle acque reflue e i sistemi di produzione suina identificati come serbatoi chiave di E. coli produttori di carbapenemasi. Questi risultati sottolineano l'importanza della gestione delle acque reflue e della sorveglianza genomica nell'ambito di un approccio One Health. Il monitoraggio continuo a livello genomico, insieme a politiche di gestione antimicrobica rafforzate, è essenziale per limitare la crescente minaccia dell'AMR.