Generation and characterization of zebrafish mutant lines for ap1s1, ap1s2 and slc7a6os, three genes of biomedical relevance

The goal of this PhD thesis was the characterization of three genes involved in rare human Mendelian disorders using zebrafish animal model. In particular, CRISPR/Cas9 genome editing technology enabled the introduction of loss of function mutations in ap1s1, ap1s2 and slc7a6os genes in Danio rerio. The first line of research was focused on the integration of previous knowledge on the adaptor protein 1 (AP-1) complex. Adaptor proteins assemble on the cytosolic face of cellular membranes to promote cargo sorting. AP-1 is usually involved in vesicular trafficking between the trans-Golgi network, the early or recycling endosomes and the plasma membrane and it is composed of four subunits (γ1, β1, μ1 and σ1). Although deficiency for the ubiquitous subunits γ1 and μ1A is lethal, knockout mice for Ap1s2 (encoding for the σ1B subunit) are viable, but reveal impaired tissue functions. Mutations in AP1S1, encoding for σ1A, are responsible for the autosomal recessive and multisystemic MEDNIK syndrome (MIM#609313). Conversely, mutations in AP1S2 are causative of an X-linked mental retardation, the Pettigrew syndrome (MIM#304340). Our CRISPR/Cas9 approach allowed the introduction of different frameshift deletions in ap1s1 and ap1s2 genes in Danio rerio and the presence of viable and fertile adult -/- individuals confirmed that deficiency of σ1A/σ1B subunit is not lethal in zebrafish. A preliminary characterization of the neurogenesis showed subtle alterations in key neural marker expression in ap1s1del4/del4 and ap1s2del5/del5 mutants, while preliminary behavioural data on larvae suggested that ap1s1del4del4 and ap1s2del5del5 mutants are characterized by faster movements, during dark periods, when compared to wild type individuals. It has been shown that AP1S1 has an important role in copper homeostasis; thus, ap1s1 zebrafish mutants were treated with high doses of copper solutions (500-1100 μg/L of CuSO4 ∙ 5 H2O dissolved in common medium water) from 0 hpf to 5 dpf. Preliminary data suggested that administration of copper to ap1s1 mutants affects survival rate in the first 5 days post fertilization and could alter the hatching capability in the same period. Further analyses will have to be performed to clarify the role of ap1s1 both in copper metabolism and in the onset of the complex phenotype of MEDNIK patients. The second line of research was focused on the characterization of slc7a6os gene, whose putative orthologue in S. cerevisiae (IWR1) has a role in the nuclear import of RNA polymerase II. Mutations in human SLC7A6OS gene are causative of a rare form of a progressive myoclonic epilepsy (MIM#619191). Crosses between heterozygotes of the del11 frameshift mutation of the slc7a6os gene in zebrafish produce viable progeny in the Mendelian genotypic ratios until 1.5 mpf, when we assist to a decrease in -/- individuals due to the death of female offspring. A few slc7a6os-/- males survive until adulthood and are characterized by morphological defects. Preliminary investigation on neurogenesis showed subtle alterations of neurod1 expression at 24 hpf and 30 hpf and in the outer region of the eye at 72 hpf of -/- individuals. In particular, abnormalities in the marginal zone and in the inner nuclear layer of Tg(neurod1:EGFP) slc7a6osΔ11-/- retinas were observed through fluorescence light sheet microscopy. Preliminary behavioural tests indicated that -/- larvae (5 dpf) show a generally high average distance travelled in dark/light phase. Therefore, adults (6 mpf) subjected to the “novel tank test” showed that -/- individuals spend more time at the bottom of the tank, in contrast to +/- and control fish, which explore all the three different zones of the tank during the test session. These behavioural changes will need to be supported by additional tests and could be related to the severe morphological defects that specifically affect -/- individuals.

L’obiettivo di questa tesi è stato la caratterizzazione di tre geni coinvolti in rare patologie mendeliane, attraverso il modello animale zebrafish. In particolare, la tecnologia di editing CRISPR/Cas9 ha permesso l’introduzione di mutazioni loss of function in ap1s1, ap1s2 e slc7a6os di Danio rerio. La prima linea di ricerca aveva come scopo l’integrazione di conoscenze pregresse sul complesso adattatore AP-1: le proteine adattatrici si assemblano sul lato citosolico delle membrane cellulari per riconoscere le molecole da trasportare. AP-1 è solitamente coinvolto nel traffico vescicolare tra il trans-Golgi, gli endosomi precoci/di riciclo e la membrana plasmatica ed è composto da quattro subunità (γ1, β1, μ1 e σ1). Sebbene il deficit di γ1 o μ1A sia letale, topi knockout per Ap1s2 (codificante σ1B) sopravvivono all’età adulta, ma presentano alterate funzioni tissutali. Mutazioni in AP1S1, codificante σ1A, sono responsabili della sindrome autosomica recessiva multisistemica MEDNIK (MIM#609313). Diversamente, mutazioni in AP1S2 causano un ritardo mentale legato al cromosoma X, la sindrome di Pettigrew (MIM#304340). CRISPR/Cas9 ha permesso l'introduzione di delezioni frameshift nei geni ap1s1 e ap1s2 in Danio rerio e la presenza di individui -/- adulti, vitali e fertili, ha confermato che la carenza di σ1A/σ1B non è letale in zebrafish. Una caratterizzazione preliminare della neurogenesi ha mostrato lievi alterazioni nell'espressione di marcatori specifici nei mutanti ap1s1del4/del4 e ap1s2del5/del5 a diversi stadi di sviluppo, mentre i risultati preliminari sul comportamento delle larve hanno suggerito che i mutanti ap1s1del4/del4 e ap1s2del5/del5 mostrano movimenti più rapidi, durante i periodi di buio, rispetto agli wild type. È stato dimostrato che AP1S1 ha un ruolo importante nell’omeostasi del rame; i mutanti zebrafish di ap1s1 sono stati trattati quindi con dosi elevate di soluzioni di rame (500-1100 μg/L di CuSO4 ∙ 5 H2O disciolti in acqua pesci) da 0 hpf a 5 dpf. I dati preliminari suggeriscono che la somministrazione di rame ai mutanti ap1s1 possa influire sul tasso di sopravvivenza nei primi 5 giorni dopo la fecondazione e potrebbe alterare la capacità di hatching nello stesso periodo. Ulteriori analisi saranno finalizzate a chiarire il ruolo di ap1s1 nel metabolismo del rame e nell'insorgenza del complesso fenotipo dei pazienti MEDNIK. La seconda linea di ricerca aveva come scopo la caratterizzazione del gene slc7a6os, il cui ortologo in S. cerevisiae (IWR1) ha un ruolo nell'importazione nucleare della RNA polimerasi II. Mutazioni a carico del gene SLC7A6OS umano causano una rara forma di epilessia mioclonica progressiva (MIM#619191). Incroci tra eterozigoti del11 di slc7a6os in zebrafish generano una progenie vitale nei rapporti genotipici mendeliani fino a 1,5 mpf, quando assistiamo ad un calo nel numero di -/- per la morte dei mutanti di sesso femminile. Alcuni maschi slc7a6os-/- sopravvivono all'età adulta ma presentano difetti morfologici. Indagini preliminari sulla neurogenesi hanno mostrato lievi alterazioni nell'espressione di neurod1 a 24 hpf e 30 hpf e nella regione esterna dell'occhio di -/- analizzati a 72 hpf. In particolare, anomalie nella zona marginale e nello strato nucleare interno della retina di individui slc7a6osΔ11-/- Tg(neurod1:EGFP) sono state riscontrate mediante microscopia light sheet a fluorescenza. Esperimenti comportamentali preliminari hanno mostrato larve -/- (5 dpf) caratterizzate da una distanza media percorsa più elevata nelle fasi di buio/luce. Gli adulti (6 mpf) sottoposti al "novel tank test" hanno mostrato individui -/- che trascorrono più tempo sul fondo della vasca, rispetto ai +/- e ai controlli, che esplorano le tre diverse zone. Tali alterazioni comportamentali dovranno essere supportate da ulteriori test e potrebbero correlarsi ai difetti morfologici caratterizzanti specificamente gli individui -/-.