Novel TLR7/8 ligands activating dendritic cells in infections and autoimmunity

Dendritic cells (DCs) are innate immune cells that play a crucial role in pathogen- and danger-signal recognition, acting rapidly in the induction of an efficient immune response. Because of their important role in bridging innate and adaptive immunity, DCs are also crucial in the pathogenesis of autoimmune diseases. DCs express different Pattern Recognition Receptors (PRRs), such as endosomal Toll like Receptor (TLR) 7/8 which recognize guanine and uracil rich (GU-rich) single stranded RNA (ssRNA) molecules of pathogens located within endosomal compartments. In physiological conditions, the interactions between TLR7/8 and endogenous RNAs are inhibited because of the different subcellular localization. However, an aberrant recognition of self-nucleic acids by TLR7/8 can lead to sterile inflammation and autoimmunity. This thesis describes two novel mechanisms of DC activation involved in both resolution of infections and unwanted inflammation and autoimmunity. The first section of the thesis characterizes DC activation induced by two GU-rich short sequences of SARS-CoV-2 genome. These sequences represent classical TLR7/8 ligands, able to induce the recruitment of MyD88 adaptor protein and the final activation of the master transcription factor NF-κB. These effects bring to different results in specific DC subsets. Indeed, TLR7 activation generated by SARS-CoV-2 sequences in plasmacytoid DCs (pDCs) induces the production of high levels of antiviral type one interferons (type I IFNs), while TLR8 activation in conventional DCs (cDCs) sustains inflammation via cytokine secretion and activates naïve T cells. The second part of the thesis describes the unconventional role of extracellular microRNAs (miRNAs) involved in the sterile activation of DCs. miRNAs are well known short ssRNA molecules, whose canonical function regards the regulation of gene expression. Recently, miRNAs have been detected in all biological fluids and the deregulation of their levels was observed in many autoimmune diseases. We hypothesize that extracellular miRNAs vehiculated by extracellular vesicles (EVs) can reach DC endosomes and activate proinflammatory signaling pathways via direct interaction with TLR7/8. In turn, unwanted DC activation generated by extracellular miRNAs could play a role in the onset of autoimmunity. Based on these premises, the role of extracellular miRNAs is evaluated in two different autoimmune contexts: rheumatoid arthritis (RA) and psoriasis. In RA, monocyte-derived DCs (moDCs) play a central role in inflamed joints, but the mechanism underlying their activation remains unknown. Here, four miRNAs previously described as upregulated in RA synovial fluids were synthesized and combined (Ex-miRNA) to stimulate moDCs. Ex-miRNA stimulation induced TLR8-dependent phenotypical maturation of moDC and TNFα production, finally resulting in T cell recruitment and Th1 polarization. Thus, moDC stimulation with Ex-miRNAs recapitulates the major contribution of this cell type to RA onset. In psoriasis, it is well characterized that tissue injury in genetically predisposed individuals paves the way to pDC activation. Based on this premises, our work demonstrated that the damage produced by UV rays on immortalized keratinocytes can drastically increase the release of EV-vehiculated miRNAs. Importantly, these miRNAs induce TLR7-dependent pDC activation and IFNa production, finally resulting in the recruitment of cytotoxic CD8+ T cells. In conclusion, this thesis investigates the mechanism of action and physiological significance of both canonical and non-canonical TLR7/8 ligands in the induction of DC activation. Since these cells play a crucial role in the modulation of the immune response, the detailed comprehension of the balance governing their physiological and pathological activation could pave the way to targeted and innovative therapeutic approaches.

Le cellule dendritiche (DCs) giocano un ruolo chiave nel riconoscimento di patogeni e di segnali di pericolo endogeni. A causa dell’importante ruolo di connessione tra immunità innata e adattativa, le DCs sono attori fondamentali nella patogenesi di malattie autoimmuni. Le DCs esprimono una vasta gamma di Pattern Recognition Receptors (PRRs), tra cui i Toll like receptor (TLR)7/8 endosomiali. Questi ultimi, in presenza di patogeni all’interno degli endosomi, vengono attivati da sequenze a singolo filamento di RNA (ssRNA) ad alto contenuto di guanina e uracile (GU-rich). In condizioni fisiologiche, i TLR7/8 non entrano in contatto con RNA endogeni. Tuttavia, l’alterazione di meccanismi di controllo può determinare l’attivazione indesiderata di questi recettori e condurre all’infiammazione sterile e all’autoimmunità. Questo lavoro di tesi andrà ad analizzare le due differenti facce della medaglia riguardanti l’attivazione delle DCs: quella volta all’eradicazione dei patogeni e quella scatenante fenomeni autoimmunitari. Nella prima parte verrà caratterizzata la risposta fisiologica di vari subsets di DCs in presenza di due differenti sequenze di ssRNA GU-rich derivanti dal genoma di SARS-CoV-2. Tali sequenze rappresentano ligandi classici dei recettori TLR7/8, in grado di determinarne l’attivazione e il seguente reclutamento della proteina adattatrice MyD88 e del fattore trascrizionale NF-κB. L’attivazione di TLR7 indotta dalle sequenze virali nelle DC plasmacitoidi (pDCs) determina la produzione di elevati livelli di interferoni (IFNs) di tipo I, a nota azione antivirale, mentre l’attivazione di TLR8 nelle DC convenzionali (cDCs) induce l’attivazione di linfociti T e la produzione di citochine proinfiammatorie. La seconda parte della tesi andrà invece a caratterizzare il ruolo non convenzionale dei microRNAs (miRNAs) extracellulari come attivatori delle DCs nel contesto di patologie autoimmuni. Recentemente la presenza di miRNAs in forma libera o in associazione con vescicole extracellulari (EVs) è stata dimostrata in tutti i fluidi biologici e alterazioni dei livelli di miRNAs extracellulari sono state osservate in diversi contesti autoimmunitari. Pertanto, ipotizziamo che, esportati all'interno di EVs, essi possano raggiungere l’endosoma delle DCs e determinare l’attivazione di TLR7/8. Tale attivazione potrebbe giocare un ruolo rilevante nell’insorgenza di fenomeni autoinfiammatori. In questo lavoro, il ruolo dei miRNAs extracellulari sarà studiato in due differenti contesti autoimmunitari: l'artrite reumatoide e la psoriasi. I nostri risultati dimostrano che la stimolazione delle moDCs, effettuata con una miscela di quattro miRNAs extracellulari, precedentemente descritti come upregolati nei liquidi sinoviali di pazienti affetti da artrite, determina l’attivazione di TLR8, induce la maturazione delle moDCs e la produzione di citochine proinfiammatorie. Nella psoriasi è noto che fattori rilasciati in seguito a danno dei cheratinociti in individui geneticamente predisposti possano indurre l’attivazione delle pDCs. Sulla base di queste premesse, il nostro lavoro dimostra che il danno prodotto dai raggi UV su una linea di cheratinociti immortalizzati induce un drastico arricchimento del quantitativo di miRNA contenuti nelle EVs rilasciate. Tali miRNA, veicolati dalle EVs, rappresentano potenti ligandi di TLR7, in grado di determinare l’attivazione delle pDCs, la conseguente produzione di IFNa e il reclutamento di cellule T CD8+. Concludendo, questa tesi caratterizza l’azione di diversi ligandi di TLR7/8, canonici e non, coinvolti nell’ attivazione delle DCs. Considerato il ruolo svolto da queste cellule nella modulazione della risposta immunitaria, una dettagliata comprensione dei meccanismi che ne regolano la fisiologia e la patologia potrà consentire l’attuazione di approcci terapeutici innovativi.