Characterization of the crosstalk between immune and Head and Neck cancer cells using the 3D collagen-base scaffold system to mimic the ECM

Introduction Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) are a heterogeneous group of malignancies originating in the squamous epithelial cells of head and neck anatomical regions. Their increasing incidence calls for awareness, early detection, and improved therapeutic approaches. Tumor microenvironment (TME) has an important influence on tumor processes and behaviors, and these biological effects are mediated not only by tumor cells but also by infiltrating cell components, and extracellular matrix (ECM). Monocytes represent the major circulating cellular fraction of innate immune cell components, and different studies have described this cell population as an important regulator of cancer processes. The lack of reliable HNSCC in vitro models mimicking the heterogeneity of TME and ECM structure represents a barrier for translational studies. The optimization of scaffold-based culture systems has increased the in vitro reliability to mimic the bio-mechanical stimuli of natural tissues. We propose a 3D biomimetic collagen-based scaffold to mimic the tumor microenvironment and the crosstalk between cancer cells, extracellular matrix (ECM), and monocytes. Materials and methods The initial steps of the project involved the synthesis of collagen-based scaffolds and a comprehensive characterization of cell monocultures (monocytes and HNSCC cells) and co-cultures. The optimal cell-seeding concentrations and culture media determined in both 2D and 3D models. MTT assays were performed to determine cell viability. The different cell growth dynamics in the 3D core and edge area were evaluated using fluorescence ubiquitination-based cell cycle indicator. The influence of tumor cells and 3D structure on monocytes polarization was studied through cytofluorimetric analysis. Results and conclusions The results obtained have enabled us to characterize a new model to study the crosstalk between tumor cells and monocytes in a 3D microenvironment. We have carefully selected the optimal cell-seeding concentrations and the best culture media for the growth of monocytes and HNSCC cells in the collagen-based scaffold structure. By a spatial point of view, the peripherical zone of the device showed a higher proportion of proliferative cells respect to the inner area, recapitulating the tissue structure typical of the tumor mass organized in a necrotic core covered by proliferative cell populations. The cytofluorimetric analysis highlighted the capability of the 3D structure to induce the polarization of monocytes to M2 macrophages through the expression of pro-inflammatory markers. Moreover, co-cultures were able to promote different kind of monocytes polarizations depending on the HNSCC cancer cell line used. All these results make our biomimetic 3D device a promising tool to increase the reliability of in vitro studies on the interaction between ECM, immune and cancer cells.

Introduzione I carcinomi a cellule squamose del distretto testa collo (HNSCCs) sono un gruppo di tumori che si originano dalle cellule squamose epiteliali delle relative sedi anatomiche. La loro crescente incidenza richiede consapevolezza, diagnosi precoce e migliori approcci terapeutici. Il microambiente tumorale ha dimostrato di avere un’importante influenza sui processi e l’andamento tumorale e questi effetti biologici vengono mediati non solo dalle cellule tumorali ma anche dalle componenti infiltrative e dalla matrice extracellulare. I monociti rappresentano la frazione circolante più numerosa della componente immunitaria innata e diversi studi hanno descritto questa popolazione come un’importante regolatore dei processi tumorali. La mancanza di modelli in vitro affidabili di HNSCCS che riproducano l’eterogeneità del microambiente tumorale e della struttura della matrice extracellulare rappresenta un limite per gli studi traslazionali. L’ottimizzazione di sistemi di colture basate su scaffold hanno aumentato l’affidabilità dell’in vitro di mimare gli stimoli bio-strutturali del tessuto naturale. Qui proponiamo uno scaffold tridimensionale basato sul collagene che mimi il microambiente tumorale ed il crosstalk tra cellule tumorali, matrice extracellulare e monociti Materiali e Metodi Le fasi iniziali di questo progetto consistono nella sintesi degli scaffold in collagene e nella caratterizzazione di monoculture (monociti e cellule di HNSCC) e co-culture. La concentrazione di semina delle cellule ed il terreno ottimale sono state determinate sia per il modello 2D che per quello 3D. Per determinare la vitalità cellulare è stato utilizzato il test dell’MTT. Le differenti dinamiche di crescita nel core e nella periferia dello scaffold sono state valutate utilizzando un indicatore fluorescente del ciclo cellulare. L’influenza delle cellule tumorale e della struttura 3D sulla polarizzazione dei monociti è stata studiata mediante citofluorimetria. Risultati e conclusioni I risultati ottenuti ci hanno permesso di caratterizzare un nuovo modello in vitro per studiare il cross-talk che si sviluppa tra cellule tumorali e monociti in un microambiente tumorale. Abbiamo accuratamente selezionato le concentrazioni di cellule seminate ed i terreni di coltura ottimali per la crescita dei monociti e delle cellule tumorali nello scaffold in collagene. Da un punto di vista spaziale, la periferia del device induce una più alta proporzione di cellule proliferanti rispetto alle regioni interne, ricapitolando la struttura tissutale tipica delle masse tumorali organizzate in un core necrotico circondato da popolazioni cellulati proliferanti. Le analisi al citofluorimetro hanno evidenziato la capacità della struttura 3D di influenzare la polarizzazione dei monociti in macrofagi M2 attraverso l’espressione di markers pro-infiammatori. In più, le coculture erano capaci di promuovere differenti tipi di polarizzazione dei monociti in base alla linea tumorale cellulare utilizzata. Tutti questi risultati fanno del nostro device 3D biomimetico un promettente strumento per aumentare l’affidabilità degli studi in vitro sulle interazioni delle cellule tumorali con la matrice extracellulare ed il sistema immunitario.