ROLE OF SPHINGOLIPID METABOLISM IN MELANOMA PROGRESSION

Sphingolipids and their metabolizing enzymes are involved in a variety of physiological and pathological conditions. During my PhD program I focused my research activity on the role of the sphingolipid metabolizing enzymes nSMase2 and GALC in cutaneous melanoma. nSMase2, encoded by SMPD3, is the enzyme responsible for the breakdown of sphingomyelin into ceramide. Previous studies demonstrated an onco-suppressive role of nMSase2 in melanoma where SMPD3 expression progressively decreases from primary to metastatic melanoma and is associated to short overall survival. Here, I overexpressed SMPD3 in A2058 and A375 human melanoma cell lines to study the role of nSMase2 in this tumor. The upregulation of SMPD3 did not impact their tumorigenic potential in in vitro assays even though preliminary in vivo results suggest an onco-protective role of nSMase2. Accordingly, A2058 nSMase2-overexpressing cells gave origin to smaller and less vascularized tumors in a tumorigenesis assay on the top of the chick embryo chorion allantoid membrane, consistent with the increased amount of ceramide that was observed in a lipidomic analysis on these cell lines. GALC is a lysosomal enzyme that cleaves β-galactose from β-galactosylceramide. Historically, GALC has been studied as a causative gene of the neurodegenerative Krabbe disease. Currently, only a limited information is available about the effect of the modulation of GALC activity on the lipidome. For this purpose, zebrafish embryos were treated with an irreversible GALC inhibitor, leading to significant alterations of the lipidic profile. Belleri et al. showed an inverse correlation between GALC and SMPD3 expression in human melanoma, demonstrating that GALC critically modulates the oncogenic activity of melanoma cells in vitro and in vivo. On this basis, GALC was overexpressed in A2058 and A375 cell lines. Data indicate that GALC upregulation induces a significant increase in the proliferative potential and motility of GALC-overexpressing cells and proteomic analysis reveals that GALC modulates proteins involved in melanoma biology, tumor immune escape, ER stress responses, mitochondrial antioxidant activity, autophagy and/or apoptosis. Melanoma progression strictly relies on angiogenesis. In this frame, previous studies demonstrated that GALC deficient mice have an impaired angio-architecture of brain vessels in post-natal angiogenesis and that their endothelium failed to respond to angiogenic factors, suggesting a role of GALC in neovascularization. Therefore, the angiogenic potential of A2058 and A375 GALC-overexpressing cells was investigate. Indeed, the s.c. grafting of these cells in mice has led to more vascularized tumors compared to controls. By mimicking what happens in tumor microenvironment where GALC is secreted by melanoma cells, the conditioned medium of GALC-overexpressing cells exerted a significant angiogenic activity in vitro and in vivo that was hampered by inhibitors of its enzymatic activity. Finally, the conditioned medium of these cells triggers the phosphorylation of the angiogenic tyrosine kinase VEGF receptor 2 and of various downstream signaling pathways in human endothelial cells. In conclusion, the data pointed out a prominent role of sphingolipid metabolizing enzymes in melanoma progression and angiogenesis.

Gli sfingolipidi sono lipidi polari coinvolti in numerosi processi biologici. Ne consegue che sia gli sfingolipidi che gli enzimi coinvolti nel loro metabolismo, sono importanti per l’omeostasi cellulare e partecipano in numerosi processi fisio-patologici. La mia ricerca mira ad investigare il ruolo degli enzimi GALC e SMPD3 nella progressione del melanoma. SMPD3 codifica per la sfingomielinase neutra di tipo 2 (nSMase2) che promuove la rimozione della testa polare dalla sfingomielina, liberando il ceramide. Studi antecedenti hanno dimostrato che l’espressione di SMPD3 decresce al progredire del melanoma ed è quindi correlata ad una ridotta sopravvivenza. In questo lavoro, SMPD3 è stato sovra-espresso in due linee di melanoma umano, le A2058 e le A375. Livelli aumentati di nSMase2 non hanno inficiato la proliferazione o la migrazione cellulare, tuttavia in un primo saggio di tumorigenesi in vivo hanno compromesso la crescita del tumore, rendendo le lesioni formate da cellule che sovra-esprimono SMPD3 più piccole e meno vascolarizzate, in linea con l’aumento di ceramide, e del suo ruolo protettivo, osservato in queste cellule. GALC è un enzima lisosomiale che rimuove il β-galattosio dal β-galattosilceramide. Mutazioni nel suo gene codificante sono la causa della malattia neurodegenerative di Krabbe. In letteratura sono presenti solo pochi studi sul profilo lipidico di modelli sperimentali o pazienti affetti da Krabbe. Per investigare come GALC modifichi la componente lipidica durante l’embriogenesi, embrioni di zebrafish sono stati trattati con un inibitore irreversibile di GALC. I risultati mostrano un’alterazione significativa della componente lipidica di questi embrioni, fornendo nuove conoscenze sul coinvolgimento della componete lipidica in questa patologia. Belleri et al., hanno mostrato che in campioni di melanoma umano c’è una correlazione inversa tra GALC e SMPD3, dimostrando che GALC esercita un’attività pro-oncogenica sulle cellule di melanoma sia in vitro che in vivo. Partendo da questi presupposti, GALC è stato sovra-espresso nelle cellule di melanoma umano A2058 e A375. I dati indicano che cellule sovra-esprimenti GALC proliferano e migrano di più rispetto al controllo. Inoltre, analisi di proteomica rivelano che GALC modula l’espressione di diverse proteine coinvolte nella regolazione del melanoma, nell’evasione della risposta immunitaria, nella risposta da stress del reticolo endoplasmatico e ossidativo. La progressione del melanoma è strettamente collegata all’angiogenesi. Per tanto il potenziale angiogenetico di queste cellule è stato valutato in un primo esperimento in vivo, dove cellule che sovra-esprimono GALC hanno prodotto lesioni più vascolarizzate. In un contesto tumorale, le cellule secernono fattori pro-angiogenetici volti a innescare il processo di angiogenesi. Si è visto che GALC non promuove la secrezione di tali fattori; tuttavia, viene secreto lui stesso dalle cellule che lo producono. Su queste basi, il terreno condizionato delle cellule che sovra-esprimono GALC è stato utilizzato in saggi di angiogenesi in vitro e in vivo dimostrando per la prima volta che GALC, attraverso la sua attività enzimatica e l’internalizzazione in cellule endoteliali, promuove la risposta angiogenetica. Questo lavoro si propone per tanto di fornire esempi esaustivi sul ruolo degli enzimi del metabolismo degli sfingolipidi nella progressione del melanoma.