Ferroptosis and Iron Metabolism in Cancer Growth

Iron is an essential micronutrient for life, but it is also required to sustain the accelerated metabolism of cancer cells. On the other hand, the increased amount of this metal causes cellular oxidative stress, promoting lipid peroxidation and causing ferroptotic cell death. Thus, the double face of iron (essential and toxic at the same time) makes it a promising target to counteract tumor growth. Therefore, in this PhD thesis we investigated the effects of ferroptosis inducers and iron modulation in two different tumor types, poorly characterized for iron metabolism and ferroptosis mechanism: glioblastoma and rhabdomyosarcoma. Glioblastoma (GBM) is the most common tumor of the central nervous system in adults and is characterized by extreme aggressiveness and elevated risk of tumor recurrence, resulting in poor patient prognosis. Recently, stem like GBM cells, named glioblastoma cancer stem cells (GBM CSCs), have been identified responsible for the resistance to current therapies and tumor relapse; therefore, new therapeutic approaches are required. In this context, we investigated whether ferroptosis inducing agents could affect the viability of GBM CSCs. We demonstrated that ferroptosis inducers can potently inhibit the growth of GBM CSC lines. Moreover, we observed that, ferroptosis inducers could increase the efficacy of temozolomide, encouraging further studies for unravelling the mechanism of ferroptosis in GBM CSCs. The other type of tumor studied in the present PhD thesis, in collaboration with Prof. Fanzani’s group (University of Brescia), is rhabdomyosarcoma (RMS), an aggressive and metastatic pediatric cancer that develops from undifferentiated myocytes. Current therapies for RMS include surgical resection followed, when required, by different strategies of aggressive chemotherapy and radiotherapy; these treatments, however, are often not curative thus requiring new therapeutic tools. Recently, since we demonstrated that iron chelators can efficiently impair RMS tumor growth, we investigated the effects on RMS cells of didox, a synthetic inhibitor of the regulatory subunit of ribonucleotide reductase RRM2 with iron chelating properties. We found that didox can effectively inhibit the in vitro growth of RMS cell lines representative of the most frequent subtypes, embryonal (ERMS) and alveolar (ARMS), also altering their motility, their clonogenic capability, and their iron status. Moreover, we demonstrated that didox was able to impair the in vivo growth of ARMS cells, suggesting that the use of this inhibitor could be effective in the treatment of RMS. Additionally, among the many molecular alterations identified in RMS, the overexpression of caveolin 1 (Cav 1) has been demonstrated to correlate with an increased sensitivity of RMS cells to ferroptosis inducers. Therefore, we investigated the mechanism of ferroptosis in Cav 1 overexpressing ERMS cells, with a particular focus on the alterations on lipid metabolism in these cells. We demonstrated that RMS cells that overexpressed Cav 1 are characterized by an altered expression of various lipid metabolism related genes and proteins. Interestingly, we found that Cav 1 overexpressing cells showed increased expression of both mRNA and protein level of long chain fatty acid CoA ligase 4 (ACSL4), the enzyme responsible for the insertion in the cell membrane of polyunsaturated fatty acids (PUFAs). Thus, we investigated the role of ACSL4 in the ferroptosis sensitivity of these cells, finding that ACSL4 seems not directly involved in the increased susceptibility to ferroptosis of these cells. Moreover, we found that the modulation of lipid content of Cav 1 overexpressing cells can alter their sensitivity to ferroptosis inducer RSL3: the treatment in combination with PUFAs further decrease the cell sensitivity to RSL3, whereas the combination with MUFAs protected the cells to RSL3-induced ferroptosis.

Il ferro è un micronutriente essenziale per la vita, ma è anche necessario per sostenere il metabolismo accelerato delle cellule tumorali. Inoltre, l’aumento dei livelli di ferro causa stress ossidativo nelle cellule, promuovendo la perossidazione lipidica e causando morte cellulare per ferroptosi. Perciò, la doppia natura del ferro (essenziale e tossico allo stesso tempo) lo rende un promettente target terapeutico nella lotta al cancro. Considerato ciò, in questa tesi di dottorato abbiamo indagato gli effetti degli induttori di ferroptosi e della chelazione del ferro in due diversi tipi di tumore entrambi poco caratterizzati per il loro metabolismo del ferro e per il meccanismo di ferroptosi: il glioblastoma e il rabdomiosarcoma. Il glioblastoma è il tumore del sistema nervoso centrale più frequente negli adulti, ed è caratterizzato da un’estrema aggressività e da un elevato rischio di recidive, risultanti in una scarsa prognosi dei pazienti. Recentemente, cellule staminali di glioblastoma, note come glioblastoma cancer stem cells (GBM CSCs), sono state identificate come responsabili della ricaduta della malattia. Perciò, abbiamo investigato sull’efficacia degli induttori di ferroptosi nel ridurre la vitalità cellulare delle GBM CSCs. Abbiamo dimostrato che gli induttori di ferroptosi inibiscono potentemente la crescita di linee di GBM CSCs in vitro. Inoltre, abbiamo osservato che gli induttori di ferroptosi aumentano l’efficacia della temozolomide, incoraggiando ulteriori analisi sul meccanismo della ferroptosi nelle GBM CSCs. L’altra tipologia di tumore studiata nel presente lavoro di tesi, in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Fanzani (all’Università di Brescia) è il rabdomiosarcoma, un tumore dell’età pediatrica aggressivo e metastatico che si sviluppa da miociti non differenziati. Le terapie attuali contro il RMS includono l’asportazione chirurgica, seguita, dove necessario, da diverse strategie combinate di chemio- e radioterapia; ciononostante, questi trattamenti risultano spesso non curativi. Siccome i chelanti del ferro possono impedire efficacemente la crescita del RMS, abbiamo investigato gli effetti su linee cellulari di RMS del didox, inibitore della ribonucleotide reduttasi con proprietà di chelante del ferro. Abbiamo scoperto che il didox inibisce significativamente la crescita in vitro di linee cellulari di RMS rappresentative dei due sottotipi più frequenti, embrionale e alveolare, riducendo inoltre la loro motilità, la loro clonogenicità e alterando il loro metabolismo del ferro. Inoltre, abbiamo dimostrato che il didox contrasta la crescita in vivo di linee cellulari di RMS alveolare, suggerendo che l’uso di questo inibitore potrebbe essere efficace nel trattamento del rabdomiosarcoma. Inoltre, tra le varie alterazioni molecolari identificate nei RMS, l’overespressione di caveolina 1 (Cav 1) è stata correlata con un aumento della sensibilità di linee cellulari di RMS agli induttori di ferroptosi. Perciò, abbiamo investigato sul meccanismo della ferroptosi in linee cellulari di RMS embrionale overesprimenti Cav 1. Abbiamo dimostrato che queste cellule esprimono livelli alterati di geni e proteine correlati al metabolismo lipidico. Inoltre, abbiamo rilevato, nelle cellule overesprimenti Cav 1, un aumento dei livelli di espressione, sia genica sia proteica, di ACSL4, l’enzima responsabile dell’inserzione nelle membrane cellulari degli acidi grassi polinsaturi. Di conseguenza, abbiamo investigato sul ruolo di ACSL4 nella sensibilità alla ferroptosi di queste cellule. Inibendo sia la sua attività sia la sua espressione, abbiamo scoperto che ACSL4 non sembra direttamente coinvolto nell’aumentata sensibilità alla ferroptosi di queste cellule. In aggiunta, abbiamo dimostrato che la modulazione del contenuto lipidico delle cellule overesprimenti Cav 1 può alterare la loro sensibilità all’induttore di ferroptosi RSL3.