Identification and interpretation of pathogenic variants following Next Generation Sequencing (NGS) analysis in human Mendelian disorders

During the PhD program the focus was to support diagnostic lab implementing validation or discover of unusual variants. This is of utmost importance to understand molecular etiopathogenic mechanisms, but also in order to offer the best counselling to families. Thus, different projects were accomplished as follows: I) a puzzling patient of a female with X-linked chronic granulomatous disorder (CGD) with a putative splicing variant: (NM_000397:ex9:c.1151+2T>C) in the CYBB gene. II) a novel hemizygous putative splicing mutation in the MAGT1 gene (NM_032121:c.627+2T>C) located on the X-chromosome. III) Analysis of Copy Number Variations (CNVs) to increase the diagnostic rate of a NGS panel for Inborn errors of immunity, as is well known that CNVs (indels between 2 and 50 megabases), account for roughly 12% of genetic abnormalities. Identifying this large variation is still problematic, especially with the Ion Torrent platforms we use for diagnostic, thus we performed an extensive in silico analysis using multiple new softwares. IV) Eight families possessing a familial or personal history of cancer underwent multigene panel testing or whole exome sequencing. Eight pathogenic variants were found and verified through Sanger sequencing or MLPA and real-time PCR. The use of NGS and CNV detection improved the diagnostic yields in cancer patients. Some of Iranian families who met Amsterdam criteria were enrolled in surveillance programs irrespective of their mutation carrier status before genetic testing, while after carrier detection disclosures only carriers were enrolled improving compliance and decreasing the managing costs

Durante il programma di dottorato, l'attenzione è stata rivolta al supporto del laboratorio di diagnostica nell'implementazione della convalida o nella scoperta di varianti insolite. Questo è di massima importanza per comprendere i meccanismi eziopatogenetici molecolari, ma anche per offrire la migliore consulenza alle famiglie. Di conseguenza, sono stati portati a termine diversi progetti come segue: I) un caso enigmatico di una femmina con un disturbo granulomatoso cronico legato all'X (CGD) con una presunta variante di splicing: (NM_000397:ex9:c.1151+2T>C) nel gene CYBB. II) una nuova presunta variante di splicing emizigote nel gene MAGT1 (NM_032121:c.627+2T>C) situato sul cromosoma X. III) Analisi delle variazioni del numero di copie (CNV) per aumentare il tasso di diagnosi di un pannello NGS per gli errori congeniti dell'immunità, poiché è ben noto che le CNV (inserzioni o eliminazioni di dimensioni comprese tra 2 e 50 megabasi) rappresentano circa il 12% delle anomalie genetiche. Identificare questa ampia variazione è ancora problematico, specialmente con le piattaforme Ion Torrent che utilizziamo per la diagnostica, pertanto abbiamo eseguito un'approfondita analisi in silico utilizzando diversi nuovi software. IV) Otto famiglie con una storia personale o familiare di cancro sono state testate per un pannello di geni multipli osono state sottoposte al sequenziamento completo dell’esoma. Sono state trovate otto varianti patogeniche e verificate tramite sequenziamento di Sanger o MLPA e PCR in Real-time. L'uso di NGS e la rilevazione di CNV hanno migliorato la diagnosi nei pazienti affetti da cancro. Alcune delle famiglie iraniane che soddisfacevano i criteri di Amsterdam sono state incluse in programmi di sorveglianza indipendentemente dal loro stato di portatori di mutazioni prima dei test genetici, mentre dopo la rivelazione del portatore solo i portatori sono stati inclusi, migliorando la conformità e riducendo i costi di gestione.