Comparative Somatic Mutational Profiling of CD34+ Hematopoietic Precursors and Circulating Endothelial Cells in Patients With Primary Myelofibrosis

Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal disorders characterized by a high rate of vascular complications. Among MPNs, primary myelofibrosis (PMF) presented also an increased bone marrow and spleen vascularity. Recently, some studies highlighted the possible influence of JAK2 mutated endothelial cells (EC) in the development of vascular complications. We explored the role of endothelium in PMF with the MyCEC study aimed at comparing the mutational profiles of Circulating Endothelial Cells (CEC) and paired CD34+ Hematopoientic stem and progenitors cells (HSPC) in patients with PMF. 17 PMF patients older than 18 years old were enrolled in the MyCEC study, together with 5 healthy controls. Median age of patients was 66 years. 11 patients were JAK2 mutated, 2 were CALR mutated, and 2 were MPL positive. Conversely, two patients did not harbor any MPN driver mutations (triple-negative). The 5 healthy controls had no known illness or history of vascular events. From patients or healthy controls, two samples of peripheral blood were collected: one for CECs detection, and the other one for HSPCs selection. CEC were detected using the CellSearch system, an FDA-approved immunomagnetic selection-based approach incorporating ferrofluid nanoparticles (anti-CD146, marker for ECs) and fluorophore-labelled antibodies (anti CD105 [endoglin protein expressed by ECs], anti CD45 [leukocytes marker] and DAPI). We identified cells as CEC when we observed the following immunophenotype: CD146+, CD105+, DAPI+ and CD45-. HSPC were selected using CD34+ immunomagnetic bead-column separation. Sequencing data on the amplified DNA from both CECs and HPSCs were assessed with the MiSeq Illumina NGS platform using a 54-gene custom panel focused on genes mutated in PMF. CECs were successful detected in all samples. The PMF patients had a higher number of CECs compared to the controls, suggesting an endothelium damage in PMF. Subsequently, CEC were collected for 13 of 17 patients and 5 healthy controls by DEEPArray system. In two of the three patients who subsequently underwent alloSCT, CEC were successfully collected also after alloSCT. HSPCs were successfully isolated in all samples, and PMF patients had a higher number of HSPCs. No mutations were found in HSPCs and CECs from healthy controls. Conversely, several somatic mutations were assessed in PMF patients. In HSPCs, 27 of the 54 genes analyzed were mutated, with a median of 4 mutations per patient. The most frequent mutated gene were JAK2 and ASXL1, followed by NOTCH1, SRSF2 and TET2. Surprisingly, all the CECs from PMF patients hold at least 1 mutation, with a median of 4 mutations/patient. 28 different genes were mutated in CECs. The JAK2 mutation was found in 2 of the 8 JAK2+ patients. TET2, KMT2A, ASXL1, TP53, SETBP1 and STAG2 were the genes more frequently mutated in CECs. When comparing mutational profiles of HSPCs and CECs, 10 of 13 patients shared at least one mutation between the two subpopulations. Two JAK2+ patients shared the MPN driver mutation, while 8 of the 10 patients shared only NON MPN-driver somatic mutations. The two patients who subsequently underwent alloSCT presented both old and new mutations on HSPCs and CECs, and the latter were in some cases shared between the two cells populations. No clinical differences were found between patients who shared mutations in HSPCs and CECs and those who did not. For the first time, the molecular profile of CECs from PMF patients have been compared with the same one of paired HSPCs. The presence of mutations only in CECs from PMF patients, strongly suggest that the acquisition of genes mutations is strictly related to the PMF development, and it may be related with vascular complications. In addition, the high frequency of patients who shared at least one mutation between HSPCs and CECs, supports the hypothesis of a common precursors between HSPCs and ECs, which might act as the cell of origin of PMF.

Le neoplasie mieloproliferative (MPN) sono disordini clonali delle cellule del sangue con un alto tasso di complicanze vascolari. Fra le MPNs, la Mielofibrosi Primaria (PMF) si caratterizza anche per una aumentata vascolarizzazione a livello splenico e midollare. Alcuni studi hanno evidenziato il possibile ruolo delle cellule endoteliali (EC) JAK2 mutate nello sviluppo di queste complicanze. Con lo studio MyCEC abbiamo voluto investigare il ruolo dell'endotelio nella PMF studiando il profilo molecolare delle cellule endoteliali circolanti (CECs) e paragonandolo a quello dei precursori ematopoietici CD34+ (HSPC). Sono stati arruolati 17 pazienti affetti da PMF, assieme a 5 soggetti sani. L’età mediana dei pazienti era di 66 anni. 11 pazienti erano JAK2 mutati, 2 CALR mutati, mentre 2 presentavano la mutazione MPL. Infine, due pazienti non presentavano alcuna mutazione driver (“tripli-negativi”). I 5 controlli sani non avevano alcuna particolare comorbidità o storia di eventi vascolari. Sia dai pazienti che dai controlli sono stati prelevati due campioni di sangue: uno per le CECs e uno per le HSPCs. Le CEC sono state identificate con il sistema CellSearch, unico ad essere approvato FDA, basato su una selezione immunomagnetica (anti-CD146, marcatore endoteliale) e con anticorpi marcati con fluoroforo (anti CD105 [endoglina espressa da EC], anti CD45 [marcatore leucociti] and DAPI). Le CEC sono state identificate come cellule con il seguente immunofenotipo: CD146+, CD105+, DAPI+ and CD45-. Le HSPCs sono state isolate per selezione immunomagnetica per il CD34+. Il DNA amplificato da CEC e HPSC è stato poi analizzato mediante piattaforma MiSeq Illumina NGS, utilizzando un pannello da noi disegnato costituito da 54 geni, noti per essere mutati nella PMF. Le CEC sono state identificate con successo in tutti i campioni. I pazienti presentavano un maggior numero di CEC, suggerendo un danno endoteliale nella PMF. Successivamente, le CEC sono state raccolte in 13 dei 17 pazienti e nei 5 controlli mediante il sistema DEEPArray, ed anche in due su tre pazienti che sono stati sottoposti ad allotrapianto di cellule staminali. Le HSPCs sono state isolate con successo in tutti i campioni, con valori maggiori nei pazienti. Nessuna mutazione è stata riscontrata nelle HSPC e nelle CEC dai controlli sani. Invece, numerose mutazioni sono state identificate nei pazienti. Nelle HSPC sono risultati mutati 27 geni, con una media di 4 mutazioni per paziente. I geni più frequente mutati sono stati JAK2 e ASXL1, seguiti da NOTCH1, SRSF2 e TET2. Sorprendentemente, tutte le CEC da pazienti avevano almeno una mutazione, con una media di 4 mutazioni per paziente. 28 geni sono risultati mutati nelle CEC. La mutazione di JAK2 è stata trovata in 2 degli 8 pazienti con JAK2+. TET2, KMT2A, ASXL1, TP53, SETBP1 e STAG2 sono i geni che sono risultati più frequentemente mutati nelle CECs. Confrontando i profili molecolari delle HSPCs e delle CECs, 10 pazienti su 13 (77%) condividevano almeno una mutazione. Due pazienti condividevano la mutazione driver JAK2+, mentre 8 su 10 condividevano altre mutazioni somatiche. Anche post allotrapianto CECs e HSPCs presentavano nuove e vecchie mutazioni, alcune delle quali condivise. Non sono state riscontrate differenze cliniche tra i pazienti che condividevano mutazioni fra HSPC e CEC e quei pazienti che non presentavano mutazioni condivise. Per la prima volta, il profilo mutazionale delle CEC da pazienti con PMF è stato analizzato e confrontato con quello delle HSPC. La presenza di alterazioni genetiche solo nei pazienti con PMF suggerisce che l’acquisizione di mutazioni sia strettamente correlata alla malattia e che possa avere un ruolo nello sviluppo di eventi vascolari. La condivisione di mutazioni fra CECs e HPSCs in una così alta percentuale di pazienti (77%) supporta l’ipotesi di un progenitore comune fra EC e HPSC, l’emangioblasto, che potrebbe agire come cellula di origine della mielofibrosi.