RNA editing of CYFIP2 regulates actin related cellular migration and neuronal development in vitro

Cytoplasmic FMRP Interacting Protein 2 (CYFIP2) is a protein originally identified as a component of Wave Regulatory Complex (WRC) and Fragile-X Mental Retardation Protein (FMRP) interactor. CYFIP2 transcript undergoes RNA editing, a post-transcriptional mechanism catalysed by ADAR enzymes, that leads adenosine to inosine deamination. CYFIP2 editing results in a K/E substitution at amino acid 320. In this study, we aim at investigating the potential implication of this process related to actin dynamics during cell migration and axon development and synaptogenesis in neural cells. Understanding the role of CYFIP2 RNA editing substitution would be fundamental for further analysis in normal and pathological conditions. Our results show that CYFIP2 RNA editing reaction increases during neural development. It is active only in the central nervous system. Taken together these data indicate that a proper CYFIP2 editing regulation is important during neuronal development and function. We have generated neuroblastoma cell lines deleted of CYFIP2 gene. The absence of CYFIP2 clearly modifies SH-SY5Y cellular morphology, leading to acting dynamic dysregulation. We have overexpressed CYFIP2 unedited and edited variants in KO cell lines, using lentivirus transduction. The overexpression of both variants are able to revert the morphological phenotype. Our results show functional differences of the edited and unedited CYFIP2 proteins in regulating cellular migration after wound healing experiments. In particular, the edited variant (CYFIP2-E) presents a stronger capability to migrate and to invade the experimental wound, both in starvation conditions and under growth factors stimulation. These data indicate that the editing reaction might be involved in the acting dynamic underlining cellular migration and proliferation.Since CYFIP2 protein is mainly expressed in neurons and K/E RNA editing reaction is active only in the central nervous system, we investigate the role of CYFIP variants on neuronal development. For this purpose, we use a well-established model of neuronal differentiation based on the application on SH-SY5Y cells of a two-step retinoic acid (RA) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) treatment to monitor the conversion of undifferentiated SH-SY5Y into neuron-like cells with distinctly polarized axon-dendritic morphology. Our results clearly demonstrate that KO cells have lost their ability to produce a characteristic neurite-like morphology after differentiation. However, no differences could be detected between K and E cell populations, indicating that CYFIP2 is important for neuronal differentiation but RNA editing isoform might have a similar function in this process for SH-SY5Y.Since the effect of K/E variants resulted irrelevant in neural maturation process using a previously described model, we took advantage of primary neuronal culture to try to understand the effect of CYFIP2 variants on neuronal maturation and spine dynamics. The expression of endogenous CYFIP2 has been down-regulated by specific shRNA and the cell culture has been transduced with lentiviral vectors expressing CYFIP2 K/E variants. During neuronal maturation a morphological parameters concerning axon development has been analysed. We found a statistically significant difference between neurons carrying K and E variants in the number of axon branches, total axon length and axon complexity index. Taken together these results suggest a clear role of CYFIP2 K/E RNA editing process in regulating the spreading of neuron axon during first stages of in-vitro development.These findings suggest that the K/E editing variations have a functional role that needs further investigation. Additionally, an in-vivo study can be useful to understand the role of CYFIP2 editing variants during neural development and function.

Cytoplasmic FMRP Interacting Protein 2 (CYFIP2) è una proteina originariamente identificata come componente del Wave Regulatory Complex e come interattore di Fragile-X Mental Retardation Protein. Il trascritto di CYFIP2 è sottoposto alla reazione di editing dell'RNA, un meccanismo post-trascrizionale catalizzato dagli enzimi ADAR, che porta l'Adenosina alla deaminazione a Inosina. In seguito al processo di traduzione, l'editing di CYFIP2 comporta una sostituzione K/E dell'amminoacido in posizione 320. Questo studio vuole indagare le potenziali implicazioni di questo processo nei fenomeni correlati alla dinamica dell'actina durante la migrazione cellulare, lo sviluppo degli assoni e la sinaptogenesi nelle cellule neurali. I nostri risultati mostrano che l’editing dell'RNA di CYFIP2 aumenta durante lo sviluppo neurale. È un processo attivo solo nel sistema nervoso centrale. Per ottenere maggiori informazioni sul ruolo dell'RNA di CYFIP2, abbiamo inizialmente eliminato il gene CYFIP2 in cellule di neuroblastoma e abbiamo sovraespresso le varianti di CYFIP2 non editate ed editate nelle linee KO. La sovra espressione di entrambe le varianti è in grado di ripristinare il fenotipo morfologico delle cellule analizzate. I nostri risultati mostrano differenze funzionali delle proteine CYFIP2 editate e non editate nella regolazione della migrazione cellulare. La variante editata presenta una maggiore capacità di migrare. Abbiamo inoltre investigato il ruolo delle varianti di CYFIP2 durante lo sviluppo neuronale. A tale scopo, abbiamo utilizzato un consolidato modello di differenziazione neuronale in cellule SH-SY5Y, basato sull'applicazione di acido retinoico (RA) e fattore di crescita neuronale (BDNF) per monitorare la conversione di cellule indifferenziato in cellule con morfologia simil-neuronale altamente polarizzata. I nostri risultati dimostrano chiaramente che le cellule KO per il gene CYFIP2 hanno perso la capacità di produrre una caratteristica morfologia simil-neuronale dopo il differenziamento, mentre la sovra espressione delle varianti di editing ne ripristina la capacità differenziativa. Tuttavia, non è stato possibile rilevare differenze tra le popolazioni di cellule K ed E, indicando come la proteina CYFIP2 sia importante per il differenziamento neuronale, ma il processo di editing potrebbe non avere un ruolo in questo processo. Per approfondire il ruolo delle varianti K e E in un sistema più fisiologico abbiamo deciso di utilizzare colture neuronali primarie di roditore. L'espressione di CYFIP2 endogeno è stata silenziata utilizzando specifici shRNA e le colture cellulari sono state trasdotte con vettori lentivirali esprimenti le varianti K o E di CYFIP2. Durante la maturazione neuronale sono stati analizzati parametri morfologici relativi allo sviluppo assonale delle cellule. Abbiamo riscontrato una differenza statisticamente significativa tra i neuroni che esprimono le varianti non editate ed editate nel numero di ramificazioni, nella lunghezza totale e nell'indice di complessità degli assoni analizzati. Abbiamo inoltre applicato il nostro modello basato sulle colture primarie ippocampali per cercare di capire se l’editing di CYFIP2 possa essere implicato nel processo di sinaptogenesi. I nostri risultati mostrano come la frequenza delle spine venga drasticamente ridotta nelle cellule in cui la proteina CYFIP2 è stata silenziata. La popolazione di cellule che esprimono in maggioranza la variante di CYFIP2 non editata (K) non portano ad un ripristino nella frequenza nelle spine che al contrario si osserva nelle cellule che si sviluppano esprimendo la variante editata di CYFIP2 (E). Nel loro insieme questi risultati mostrano un chiaro ruolo della proteina CYFIP2 nella regolazione dello sviluppo assonale durante le prime fasi dello sviluppo in vitro e durante il processo di sinaptogenesi. La reazione K/E di editing dell'RNA del trascritto risulta inoltre importante in entrambi i processi studiati.