Malignant tumor cells recruit normal cells from surrounding tissue, creating a sophisticated microenvironment composed of tumor cells, immune cells, fibroblasts, adipocytes, macrophages, endothelial cells (ECs), and the extracellular matrix (ECM). Besides being a reservoir of soluble factors, the ECM provides cells with a physical scaffold and has a dynamic role in the evolution and spread of cancers. The ECM consists of a complex fibrous protein network (including collagen, laminin, and fibronectin), proteoglycans, and non-proteoglycan polysaccharides. The ensemble of molecular composition and stiffness of ECM supports and transduces mechanical forces to both tumor and stromal cells, regulating tumor growth and homeostasis. Abundant and aberrant ECM proteins have been associated with poor prognosis and reduced response to therapy. Moreover, the ECM is also subjected to a continuous cycle of deposition and remodeling from cancer cells and tumor-associated stromal cells, creating a cancer-supporting matrix. However, it is less clear how tissue stiffening relates to tumor evolution. The vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) is commonly dysregulated in cancer, resulting in aberrant intracellular signaling, altered metabolism, increased cell proliferation, and poor prognosis. Here we investigated how R1032Q, the most frequent non-synonymous inactivating mutation of VEGFR2, promotes tumor growth. Although the R1032Q substitution entails a loss of receptor function, the “inactive” VEGFR2R1032Q confers a selective growth advantage to cancer cells. Indeed, in a melanoma model with heterozygous R1032Q mutation of VEGFR2, VEGFR2R1032Q increases cell proliferation, tumor growth, and metastasis. Our analysis showed that mutated VEGFR2R1032Q forms functional heterodimers with wild-type VEGFR2 increasing the VEGFR2-associated intracellular signaling without exogenous VEGF-A stimulation. Also, we show that the expression of the VEGFR2R1032Q mutant in Sk-Mel-31 melanoma cells results in fast growth and highly vascularized tumors when injected s.c.in mice. Furthermore, label-free SHG imaging highlights that tumors harboring VEGFR2R1032Q have a highly modified ECM organization with directed matrix bundles formed compared with VEGFR2WT tumors. In vitro experiments demonstrated that decellularized ECM (dECM) produced by VEGFR2R1032Q Sk-Mel-31 favors the adhesion of EC, increasing the number of focal adhesion plaques. Functional analysis, using the FRET-based VinTS tensor mechanosensor, reveals higher tensile forces generated in FA plaques in ECs seeded on dECM of Sk-Mel-31 VEGFR2R1032Q compared with ECs plated on dECM of Sk-Mel-31 VEGFR2WT. dECM of VEGFR2R1032Q Sk-Mel-31 also promotes EC migration and wound repair and induces relevant metabolic changes. In conclusion, our data suggest that ECM produced by VEGFR2R1032Q Sk-Mel-31 can alter EC behavior inducing a pro-adhesive and pro-migratory phenotype that might promote aggressiveness and metastasization of tumors harboring this mutation.

I tumori sono tessuti complessi in cui le cellule tumorali coesistono insieme a varie cellule del tessuto circostante creando un microambiente molto sofisticato. Il microambiente tumorale è infatti un tessuto composto da cellule tumorali, cellule immunitarie, fibroblasti, cellule adipose, macrofagi, cellule endoteliali e dalla matrice extracellulare (ECM). L’ECM è formata da una complessa rete proteica, come collagene, laminina, fibronectina, proteoglicani e polisaccaridi non proteoglicani. Questa rete fornisce un sostegno fisico per le cellule, è anche deputata all’idratazione del tessuto, funge da serbatoio di fattori solubili, e supporta e trasduce le forze meccaniche che influenzano e regolano la crescita del tumore. I cambiamenti nella meccanica cellulare e tissutale sono tra i segni distintivi del cancro. Tuttavia, è meno chiaro come l'irrigidimento dei tessuti sia correlato all'evoluzione del tumore. Il recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR2) è frequentemente disregolato nei tumori, con conseguente segnalazione intracellulare aberrante, metabolismo alterato, aumento della proliferazione cellulare e prognosi infausta. Qui abbiamo studiato il meccanismo con cui la sostituzione inattivante R1032Q, la più frequente mutazione non sinonimo di VEGFR2, promuove la crescita del tumore. Sebbene la sostituzione R1032Q comporti la perdita dell’attività chinasica del recettore, il VEGFR2R1032Q “inattivo” conferisce un vantaggio di crescita selettiva alle cellule tumorali. Infatti, in un modello di melanoma esprimente la mutazione R1032Q in eterozigosi con il recettore WT, VEGFR2R1032Q aumenta la proliferazione cellulare, la crescita e la capacità metastatica del tumore. La nostra analisi ha mostrato che VEGFR2R1032Q mutato forma eterodimeri funzionali con VEGFR2WT aumentando la segnalazione intracellulare associata a VEGFR2 in assenza di stimolazione esogena con VEGF-A. Inoltre l’analisi dei tumori derivati dall’inoculo del modello isogenico di melanoma nel sottocute di topo ha evidenziato che la capacità pro-oncogenica del mutante R1032Q è dovuta, almeno in parte, al rimodellamento della ECM e da una maggiore vascolarizzazione. Attraverso diverse tecniche di imaging mostriamo che i tumori esprimenti la mutazione hanno una diversa organizzazione della ECM rispetto ai tumori esprimenti il recettore WT, con fasci di matrice più abbondanti ma meno direzionati. Per capire se la riorganizzazione della matrice influisca sulla vascolarizzazione del tumore, abbiamo studiato come le matrici prodotte dalle cellule Sk-Mel-31 modulano il comportamento delle cellule endoteliali (EC) in vitro. Ancora, mediante tecniche di microscopia avanzata (alta risoluzione, FLIM/FRET), abbiamo evidenziato che la matrice decellularizzata (dECM) prodotta dalle cellule esprimenti VEGFR2R1032Q favorisce l'adesione delle EC modulando sia il numero di placche di adesione focale che le forze meccaniche intracellulari da queste mediate. L’adesione su dECM prodotte da cellule esprimenti VEGFR2R1032Q promuove uno switch verso un fenotipo angiogenico, l’alterazione del metabolismo cellulare e la transizione verso un fenotipo più mesenchimale, compatibile con le caratteristiche di aumentata motilità cellulare dimostrata con esperimenti di migrazione. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che la ECM prodotta da cellule esprimenti VEGFR2R1032Q può alterare il comportamento delle EC inducendo un fenotipo pro-adesivo e pro-migratorio che potrebbe promuovere l'aggressività e la metastasi dei tumori che ospitano questa mutazione.

VEGFR2 inattivo promuove la crescita tumorale modulando le caratteristiche meccaniche della matrice extra-cellulare / Corsini, Michela. - (2023 Feb 16).

VEGFR2 inattivo promuove la crescita tumorale modulando le caratteristiche meccaniche della matrice extra-cellulare

CORSINI, Michela
2023-02-16

Abstract

Malignant tumor cells recruit normal cells from surrounding tissue, creating a sophisticated microenvironment composed of tumor cells, immune cells, fibroblasts, adipocytes, macrophages, endothelial cells (ECs), and the extracellular matrix (ECM). Besides being a reservoir of soluble factors, the ECM provides cells with a physical scaffold and has a dynamic role in the evolution and spread of cancers. The ECM consists of a complex fibrous protein network (including collagen, laminin, and fibronectin), proteoglycans, and non-proteoglycan polysaccharides. The ensemble of molecular composition and stiffness of ECM supports and transduces mechanical forces to both tumor and stromal cells, regulating tumor growth and homeostasis. Abundant and aberrant ECM proteins have been associated with poor prognosis and reduced response to therapy. Moreover, the ECM is also subjected to a continuous cycle of deposition and remodeling from cancer cells and tumor-associated stromal cells, creating a cancer-supporting matrix. However, it is less clear how tissue stiffening relates to tumor evolution. The vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) is commonly dysregulated in cancer, resulting in aberrant intracellular signaling, altered metabolism, increased cell proliferation, and poor prognosis. Here we investigated how R1032Q, the most frequent non-synonymous inactivating mutation of VEGFR2, promotes tumor growth. Although the R1032Q substitution entails a loss of receptor function, the “inactive” VEGFR2R1032Q confers a selective growth advantage to cancer cells. Indeed, in a melanoma model with heterozygous R1032Q mutation of VEGFR2, VEGFR2R1032Q increases cell proliferation, tumor growth, and metastasis. Our analysis showed that mutated VEGFR2R1032Q forms functional heterodimers with wild-type VEGFR2 increasing the VEGFR2-associated intracellular signaling without exogenous VEGF-A stimulation. Also, we show that the expression of the VEGFR2R1032Q mutant in Sk-Mel-31 melanoma cells results in fast growth and highly vascularized tumors when injected s.c.in mice. Furthermore, label-free SHG imaging highlights that tumors harboring VEGFR2R1032Q have a highly modified ECM organization with directed matrix bundles formed compared with VEGFR2WT tumors. In vitro experiments demonstrated that decellularized ECM (dECM) produced by VEGFR2R1032Q Sk-Mel-31 favors the adhesion of EC, increasing the number of focal adhesion plaques. Functional analysis, using the FRET-based VinTS tensor mechanosensor, reveals higher tensile forces generated in FA plaques in ECs seeded on dECM of Sk-Mel-31 VEGFR2R1032Q compared with ECs plated on dECM of Sk-Mel-31 VEGFR2WT. dECM of VEGFR2R1032Q Sk-Mel-31 also promotes EC migration and wound repair and induces relevant metabolic changes. In conclusion, our data suggest that ECM produced by VEGFR2R1032Q Sk-Mel-31 can alter EC behavior inducing a pro-adhesive and pro-migratory phenotype that might promote aggressiveness and metastasization of tumors harboring this mutation.
16-feb-2023
I tumori sono tessuti complessi in cui le cellule tumorali coesistono insieme a varie cellule del tessuto circostante creando un microambiente molto sofisticato. Il microambiente tumorale è infatti un tessuto composto da cellule tumorali, cellule immunitarie, fibroblasti, cellule adipose, macrofagi, cellule endoteliali e dalla matrice extracellulare (ECM). L’ECM è formata da una complessa rete proteica, come collagene, laminina, fibronectina, proteoglicani e polisaccaridi non proteoglicani. Questa rete fornisce un sostegno fisico per le cellule, è anche deputata all’idratazione del tessuto, funge da serbatoio di fattori solubili, e supporta e trasduce le forze meccaniche che influenzano e regolano la crescita del tumore. I cambiamenti nella meccanica cellulare e tissutale sono tra i segni distintivi del cancro. Tuttavia, è meno chiaro come l'irrigidimento dei tessuti sia correlato all'evoluzione del tumore. Il recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR2) è frequentemente disregolato nei tumori, con conseguente segnalazione intracellulare aberrante, metabolismo alterato, aumento della proliferazione cellulare e prognosi infausta. Qui abbiamo studiato il meccanismo con cui la sostituzione inattivante R1032Q, la più frequente mutazione non sinonimo di VEGFR2, promuove la crescita del tumore. Sebbene la sostituzione R1032Q comporti la perdita dell’attività chinasica del recettore, il VEGFR2R1032Q “inattivo” conferisce un vantaggio di crescita selettiva alle cellule tumorali. Infatti, in un modello di melanoma esprimente la mutazione R1032Q in eterozigosi con il recettore WT, VEGFR2R1032Q aumenta la proliferazione cellulare, la crescita e la capacità metastatica del tumore. La nostra analisi ha mostrato che VEGFR2R1032Q mutato forma eterodimeri funzionali con VEGFR2WT aumentando la segnalazione intracellulare associata a VEGFR2 in assenza di stimolazione esogena con VEGF-A. Inoltre l’analisi dei tumori derivati dall’inoculo del modello isogenico di melanoma nel sottocute di topo ha evidenziato che la capacità pro-oncogenica del mutante R1032Q è dovuta, almeno in parte, al rimodellamento della ECM e da una maggiore vascolarizzazione. Attraverso diverse tecniche di imaging mostriamo che i tumori esprimenti la mutazione hanno una diversa organizzazione della ECM rispetto ai tumori esprimenti il recettore WT, con fasci di matrice più abbondanti ma meno direzionati. Per capire se la riorganizzazione della matrice influisca sulla vascolarizzazione del tumore, abbiamo studiato come le matrici prodotte dalle cellule Sk-Mel-31 modulano il comportamento delle cellule endoteliali (EC) in vitro. Ancora, mediante tecniche di microscopia avanzata (alta risoluzione, FLIM/FRET), abbiamo evidenziato che la matrice decellularizzata (dECM) prodotta dalle cellule esprimenti VEGFR2R1032Q favorisce l'adesione delle EC modulando sia il numero di placche di adesione focale che le forze meccaniche intracellulari da queste mediate. L’adesione su dECM prodotte da cellule esprimenti VEGFR2R1032Q promuove uno switch verso un fenotipo angiogenico, l’alterazione del metabolismo cellulare e la transizione verso un fenotipo più mesenchimale, compatibile con le caratteristiche di aumentata motilità cellulare dimostrata con esperimenti di migrazione. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che la ECM prodotta da cellule esprimenti VEGFR2R1032Q può alterare il comportamento delle EC inducendo un fenotipo pro-adesivo e pro-migratorio che potrebbe promuovere l'aggressività e la metastasi dei tumori che ospitano questa mutazione.
VEGFR2 inattivo promuove la crescita tumorale modulando le caratteristiche meccaniche della matrice extra-cellulare / Corsini, Michela. - (2023 Feb 16).
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Tesi_Corsini.pdf

embargo fino al 15/02/2025

Descrizione: Tesi
Tipologia: Tesi di dottorato
Dimensione 23.9 MB
Formato Adobe PDF
23.9 MB Adobe PDF   Visualizza/Apri   Richiedi una copia

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11379/570889
 Attenzione

Attenzione! I dati visualizzati non sono stati sottoposti a validazione da parte dell'ateneo

Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact