DECOMPOSING BONES: FORENSIC INVESTIGATION OF ASSOCIATION BETWEEN HISTOLOGICAL AND GENETIC ANALYSIS.

Bone analysis plays an important role in forensic cases when unidentified skeletonized human remains are found. The frequency of casework involving bone fragments in forensic medicine is on the rise. Among the factors that contribute to this increase are criminal activity (e.g. blast trauma, gunshot injury and blunt force trauma) and taphonomic factors. Histological evaluation has been used to better understand diagenesis and DNA preservation in post-mortem bones. To these days, little is known about where and how DNA is preserved within bone samples and only few studies have investigated the relationship between bone histological feature and DNA yield as a way to predict successful nuclear DNA typing. DNA typing in remains of human bones is particularly hard due to the extreme degradation of DNA. When working with materials that contain few viable cells, it is essential to develop strategies for highly efficient extraction of DNA. Nowadays there are many different DNA extraction protocols from bones but still there is no consensus about which one is the best. The objective of this research was to conduct histological and genetic analysis in 20 femur sample collected from unidentified human bodies found in an advanced state of decomposition in mid-west Brazil. In order to reach this aim, thin sections of fragmentary bones were analyzed under a microscope and the main histological features were collected. Afterwards, the same fragmentary bone sections were subjected to genetic investigations performed with the same kit applied in three different methods, to ascertain which was the best at extracting DNA from bones. It was investigated the Standard DNA extraction protocol for bone by the Crime Prep Adem-Kit (Pessac, France) and two modified protocols using EDTA-based approaches. Both histological and genetic results were compared to verify any possible correlation. The microscopic aspect showed high Oxford Histological Index scores in both undecalcified and decalcified sections, highlighting a good histomorphological bone preservation, in line with their post-mortem interval (“contemporary” bones, from 6 to 13 years). Statistical analysis using Spearman's rank-order correlation suggested a negative correlation between the Area of the Haversian System and the decalcification time (rs= -0.55; p=0.01), but no significant correlation with the PMI (p=0.89). No significant correlations were found with Haversian Canal area and decalcification time (p=0.81) or PMI (p=0.87). The number of lacunae was directly proportional to number of nuclei (rs=0.83; p=<0.05), whilst no significant correlations were found with number of lacunae and post-mortem interval (p=0.71). The bone integrity index, calculated as a ratio between the number of nuclei and lacunae for each specimen, was 0.027 ± 0.018, with a range from 0 to 0.051. Results obtained showed a positive correlation between the decalcification time and the DNA concentration for small autosomal retrieved in protocol A (rs=0.48; p=0.03), whilst no significant correlation were found with the other protocols. No significant correlation was found between osteocytes nuclei number observed and the DNA concentration, and there was no association between the bone degradation and DNA quality and quantity. Of the three investigated DNA extraction methods, one of the adapted protocols showed a slightly better performance, suggesting a beneficial impact of EDTA supplementation. Therefore, the proposed modified protocol could be used in alternative to the standard one. The lack of significant research in this topic highlights the need for further investigation in the possible correlation between DNA yield and microscopic features. Keywords: forensic genetics, bones, histology, DNA, human remains, decomposition, post-mortem diagenesis.

In ambito forense, l’analisi del tessuto osseo è di fondamentale importanza in quei casi che richiedono l’identificazione di resti scheletrici umani. Negli ultimi decenni si è osservato un interesse sempre maggiore verso lo studio dei frammenti ossei, favorito dall’aumento di eventi criminali e catastrofi ambientali. Le indagini istologiche del tessuto osseo rappresentano uno strumento efficace per lo studio delle alterazioni microstrutturali post-mortali, al fine di predire lo stato di conservazione del DNA. Ad oggi, non sono ancora stati chiariti i fenomeni alla base della preservazione del DNA nei tessuti ossei e solo pochi studi hanno indagato la possibile correlazione tra le caratteristiche microscopiche dell’osso e la quantificazione del DNA, con l’obiettivo di prevedere il successo della tipizzazione del DNA nucleare. La genotipizzazione del DNA nei frammenti ossei è resa particolarmente difficile dell'estrema degradazione dell’acido desossiribonucleico. Nonostante gli avanzamenti nelle tecniche genetiche e lo sviluppo di nuove strategie di estrazione del DNA dal tessuto osseo, esistono svariati protocolli nessuno dei quali possa definirsi gold standard. Il presente studio si è incentrato sull’analisi di 20 frammenti di femore di soggetti non identificati, rinvenuti in Brasile in avanzato stato di decomposizione. Nella prima fase della ricerca, sottili sezioni ricavate dai campioni ossei sono state analizzate al microscopio per verificarne lo stato di conservazione e si è proceduto alla raccolta di alcuni parametri metrici. Nella seconda fase dello studio, le sezioni ossee sono state sottoposte ad indagini genetiche applicando il protocollo di estrazione del DNA Crime Prep Adem-Kit (Pessac, Francia) nella sua versione standard e in due versioni alternative, modificate con aggiunta di EDTA, al fine di verificare quale risultasse migliore. Infine, i risultati delle analisi istologiche e genetiche sono stati confrontati per verificare la presenza e la significatività di possibili correlazioni. L'aspetto microscopico delle ossa ha mostrato alti punteggi dell’OHI evidenziando una buona conservazione istomorfologica dei tessuti, in linea con il loro intervallo post-mortale (da 6 a 13 anni). L'analisi statistica, sulla base dell’indice di correlazione di Spearman, ha suggerito una correlazione negativa tra l'area del sistema haversiano e il tempo di decalcificazione (rs= -0,55; p=0,01), mentre non ha evidenziato alcuna correlazione significativa con il PMI (p=0,89). Nessuna correlazione significativa è stata trovata tra l'area del canale di Havers ed il tempo di decalcificazione (p=0,81) o il PMI (p=0,87). Il numero di lacune era direttamente proporzionale al numero di nuclei osservati (rs=0,83; p=<0,05), mentre non sono state trovate correlazioni significative con il numero di lacune e l'intervallo post mortem (p=0,71). I risultati ottenuti hanno mostrato una correlazione positiva tra il tempo di decalcificazione e la concentrazione di DNA small nel protocollo Standard (rs=0,48; p=0,03), mentre nessuna correlazione significativa è stata trovata con gli altri protocolli. Nessuna correlazione significativa è stata trovata tra il numero di nuclei di osteociti osservati e la concentrazione di DNA, così come non si è evidenziata alcuna associazione tra la degradazione dell'osso ed il dato qualitativo e quantitativo del DNA. Dei tre metodi di estrazione studiati, uno dei protocolli modificati ha mostrato una performance lievemente migliore, suggerendo un impatto benefico dell'aggiunta di EDTA, proponendosi come valida alternativa a quello standard. La carenza di ricerche in questo ambito evidenzia la necessità di ulteriori indagini volte ad indagare la correlazione tra le caratteristiche microscopiche e la resa del DNA.