ASSESSING THE USEFULNESS OF RAMAN SPECTROSCOPY AND LIPID ANALYSIS OF DECOMPOSED HUMAN BONES IN FORENSIC GENETICS AND MOLECULAR TAPHONOMY STUDIES

Il test del DNA forense è l'applicazione di analisi genetiche per aiutare a chiarire le controversie legali. Le analisi del DNA possono essere eseguite non solo su campioni biologici di persone viventi, ma anche su individui deceduti o sui loro resti decomposti. Tali analisi sono state estremamente preziose per la società, consentendo l'identificazione formale di innumerevoli persone scomparse e resti umani non identificati. In pratica, gli organi mineralizzati, come le ossa, sono tra le strutture con maggiori probabilità di essere recuperate dopo la morte. La decomposizione è un processo complesso che porta alla trasformazione e alla degradazione di tutte le molecole, compreso il DNA. Tuttavia, le proprietà fisico-chimiche che conferiscono alle ossa la loro resilienza post mortem diventano i principali ostacoli quando il DNA deve essere estratto per l'analisi. Pertanto, l'analisi genetica sulle ossa è laboriosa e tecnicamente impegnativa. Le tecniche fisico-chimiche, come la spettroscopia vibrazionale, hanno il potenziale per essere utilizzate come strumento di screening per l'analisi del DNA dalle ossa. Altre tecniche molecolari, come la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC/MS), possono anche aiutare a fare luce sul processo di decomposizione e migliorare l'efficienza dell'analisi del DNA. L'obiettivo di questa ricerca era di condurre indagini molecolari alternative sulle ossa decomposte per valutarne l'utilità nella ricerca di base e nella casistica forense. Sono stati studiati campioni di femore raccolti da 50 corpi umani trovati in uno stato avanzato di decomposizione. La spettroscopia Raman è stata condotta su fette sottili di femore e la GC/MS è stata eseguita su lipidi estratti da campioni in polvere. È stata inoltre eseguita la valutazione della quantità, della qualità e dell'efficienza della genotipizzazione della ripetizione in tandem breve (STR) del DNA nucleare dai frammenti del femore. Sono stati registrati i parametri Raman (cristallinità, rapporto carbonato/fosfato, rapporto minerale/matrice) e lipidi rilevati mediante GC/MS. Nei campioni ossei sono stati rilevati sei tipi di esteri metilici degli acidi grassi (FAME) e alcuni idrocarburi. È stato dimostrato che la posizione del picco principale del fosfato negli spettri Raman è significativamente correlata al DNA conservato (p = 0,03713). Tuttavia, i restanti parametri Raman e lipidi rilevati non erano significativamente correlati alla presenza del DNA né all'efficienza della tipizzazione STR. Anche se l'elevata fluorescenza di fondo ha rappresentato una sfida nella spettroscopia Raman, ostacolando l'analisi del 18% (9 su 50) dei femori studiati, può essere un utile strumento di screening nella genetica forense. Il rilevamento di FAME nella matrice ossea suggerisce una reazione tra il metanolo prodotto dai batteri e gli acidi grassi liberi, che non sembra influenzare il livello di conservazione del DNA endogeno. Nel complesso, le tecniche molecolari studiate hanno dimostrato che la previsione del successo della genotipizzazione è impegnativa anche in PMI brevi, come in contesti forensi.

Forensic DNA testing is the application of genetic analyses to help elucidate legal disputes. DNA analyses can be performed not only on biological samples from living persons, but also from deceased individuals or their decomposed remains. Such analyses have been extremely valuable to society, allowing the formal identification of countless missing persons and unidentified human remains. In practice, mineralized organs, such as bones, are among the structures most likely to be recovered after death. Decomposition is a complex process that leads to transformation and degradation of all molecules, including DNA. However, the physicochemical properties that give bones their post-mortem resilience become major obstacles when DNA is to be extracted for analysis. Thus, genetic analysis on bones is laborious and technically challenging. Physicochemical techniques, such as vibrational spectroscopy, have the potential to be used as a screening tool for DNA analysis from bones. Other molecular techniques, such as gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC/MS) may also help to shed light onto the decomposition process and improve efficiency of DNA analysis. The objective of this research was to conduct alternative molecular investigations on decomposed bones to assess their utility in basic research and forensic casework. Femur samples collected from 50 human bodies found in an advanced state of decomposition were studied. Raman spectroscopy was conducted on thin femur slices and GC/MS was carried out on lipids extracted from powdered samples. Assessment of nuclear DNA quantity, quality, and short tandem repeat (STR) genotyping efficiency from femur fragments was also performed. Raman parameters (crystallinity, carbonate to phosphate ratio, mineral to matrix ratio) and lipids detected by GC/MS were recorded. Six types of fatty acid methyl esters (FAMEs) as well as some hydrocarbons were detected in the bone samples. The main phosphate peak position in Raman spectra was shown to be significantly correlated with preserved DNA (p=0.03713). However, remaining Raman parameters and lipids detected were not significantly correlated with DNA presence nor STR typing efficiency. Even though high background fluorescence posed a challenge in Raman spectroscopy, hampering analysis of 18% (9 of 50) of the femurs studied, it may be a useful screening tool in forensic genetics. The detection of FAMEs in the bone matrix suggests a reaction between methanol produced by bacteria and free fatty acids, which does not seem to impact the level of preservation of endogenous DNA. Overall, the molecular techniques studied have showed that the prediction of genotyping success is challenging even in short PMIs, such as in forensic contexts.