ZEBRAFISH AS AN EXPERIMENTAL MODEL OF NEURODEVELOPMENTAL AND NEURODEGENERATIVE DISORDERS: FROM SYNAPSIN III KNOCKDOWN TO α-SYNUCLEIN TRANSGENIC ZEBRAFISH LARVAE

Il sistema nervoso di Zebrafish (Danio rerio) gode di una notevole conservazione anatomica e funzionale rispetto all’uomo offrendo,quindi, la possibilità di studiare gli aspetti patofisiologici del sistema nervoso.In questo progetto ho utilizzato lo Zebrafish per lo studio di due proteine sinaptiche coinvolte nel neurosviluppo e nella neurodegenerazione: Sinapsina III (SynIII) e α-sinucleina (α-syn).SynIII è una proteina neuronale espressa ad alti livelli nelle fasi precoci dello sviluppo dei neuroni corticali e ippocampali. Nell’adulto essa controlla il rilascio di dopamina.Polimorfismi di SynIII sono associati al disturbo da deficit dell’attenzione/iperattività (ADHD), caratterizzato da alterazioni a carico del sistema dopaminergico. Il rilascio di dopamina SynIII-dipendente avviene in cooperazione con α-syn,tra le più abbondanti proteine del sistema nervoso, nel quale regola l’omeostasi e la funzionalità neuronale.Essa rappresenta però anche uno dei principali marcatori della malattia di Parkinson (Parkinson Disease, PD). Il cervello dei pazienti affetti è infatti caratterizzato dalla presenza di inclusioni insolubili contenenti aggregati fibrillari di α-syn. Recentemente, SynIII è stata identificata come un altro fattore chiave nella composizione di questi aggregati, nei quali agirebbe come principale fattore stabilizzante delle fibrille di α-syn. Obiettivi & Risultati L’obiettivo del mio progetto è stata la generazione di modelli di PD e ADHD in zebrafish, volti alla comprensione del contributo di SynIII e α-syn all’insorgenza di queste patologie. Obiettivi specifici: 1)Studiare il ruolo di SynIII nello sviluppo dei neuroni dopaminergici utilizzando un modello di silenziamento genico-morfolino dipendente. 2)Generare una linea transgenica di zebrafish per il gene umano codificante α-syn (hsa.SNCA), al fine di studiare l’interazione patologica α-syn/SynIII. Obiettivo1-Task1: Per studiare il coinvolgimento di SynIII nello sviluppo dei neuroni dopaminergici, ho eseguito il silenziamento del gene Syn3 in embrioni di zebrafish. Gli embrioni silenziati mostrano una notevole riduzione nello sviluppo del sistema nervoso e alterazioni comportamentali. Nello specifico, i morfanti sono caratterizzati da modificazioni nella morfologia cerebrale, risultato di una riduzione nei processi di proliferazione e differenziamento neuronale. Difatti, la tecnica di ibridazione in situ ha evidenziato una riduzione di marker di neuroni immaturi, in particolar modo nelle aree cerebrali che ospitano i neuroni dopaminergici. Coerentemente, è stata ivi osservata una riduzione significativa di cellule positive per la tirosina-idrossilasi. Nella coda, il silenziamento di Syn3 ha comportato una compromissione nell’estensione degli assoni. Valutazioni nei morfanti del comportamento motorio spontaneo (tail coiling) e stimolo-indotto (touch-evoked) hanno rivelato un’iperattività basale che richiama l’ADHD. La coiniezione di morfolino e del messaggero codificante per SynIII di Rattus Norvegicus previene la comparsa dei deficit nel processo di sviluppo dei neuroni dopaminergici, dimostrando la specifità del morfolino e la conservazione funzionale di SynIII in specie diverse. Questi risultati evidenziano il coinvolgimento di SynIII nello sviluppo del sistema dopaminergico e forniscono nuovi spunti per la comprensione dei disturbi ad esso correlati. Obiettivo2-Task2: La generazione della linea transgenica di zebrafish hsa.SNCA come nuovo modello di PD, è stata effettuata mediante creazione di un vettore Tol2 in grado di esprimere il gene hsa.SNCA con un tag mCherry N-terminale (mChα-syn) sotto la guida del promotore pan-neuronale elavl3. mChα-syn risulta espressa nel soma e nelle ramificazioni neuronali, non correlata ad una riduzione della vitalità cellulare o ad una compromissione delle funzioni neurologiche. Questo studio rappresenta il primo passo nella generazione di un nuovo modello di PD in zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) brain anatomy and function exhibit a remarkable homology to those of humans, thus offering the possibility to carry out studies addressing key pathophysiological aspects of the nervous system. In this project, I exploited zebrafish to study the pathophysiological function of two key synaptic proteins involved in neurodevelopment and neurodegeneration: Synapsin III (SynIII) and α-synuclein (α-syn). SynIII is a neuron-specific phosphoprotein highly expressed in the early stages of cortical and hippocampal neurons development, while in mature neuronal cells, it controls dopamine release. SynIII polymorphisms have been associated with attention deficits and hyperactivity disorder (ADHD), which is characterized by significant alterations in dopaminergic systems development and function. Of note, SynIII-dependent dopamine release occurs in cooperation with α-syn. This is one of the most abundant synaptic proteins in the nervous system, where it regulates neuronal function and homeostasis. However, α-syn is also a main pathological marker for Parkinson’s disease (PD), as the brain of patients affected by this neurodegenerative disorder is characterized by the deposition of insoluble inclusions mainly composed of fibrillary aggregated α-syn. Notably, SynIII has been recently identified as another key component of these aggregates. In particular, it functions as a main stabilizer of α-syn pathological fibrils. Aims & Results My project aimed at the generation of novel zebrafish models of ADHD and PD to study the pathophysiological function of SynIII and α-syn in these disorders. Specific aims: 1) To study the role of SynIII in dopaminergic neurons development by using a morpholino knock-down-based zebrafish model. 2) To generate a novel human α-syn (hsa.SNCA) transgenic zebrafish line to study SynIII/α-syn pathological interplay. Aim 1-Task 1: To study the involvement of SynIII in dopaminergic neurons development I perfomed morpholino-mediated syn3 knock down (KD) in zebrafish embryos. Syn3 KD embryos, exhibited a significant reduction of central nervous system development and altered behavior. In particular, Syn3 morphants displayed microcephaly and perturbation of brain morphology as a result of the reduction of neuronal proliferation and differentiation. Consistently, in situ hybridization showed a significant reduction of markers of early forming neurons, particularly in the brain areas hosting dopaminergic nuclei in the syn3 KD embryos. Consistently, I detected a significant reduction of tyrosine-hydroxilase (TH)-immunopositive cells. In the trunk, syn3 KD affected axon elongation, as branches length within somites appeared significantly reduced. The spontaneous tail-coiling measurement and the touch-evoked test revealed that syn3 KD is associated with a hyperactive behavior reminiscent of ADHD. Finally, the co-injection of syn3 morpholino with a plasmid transducing Rattus Norvegicus SynIII mRNA prevented the onset of the neurodevelopmental dopaminergic deficits, demonstrating the specificity of our morpholino and the conserved function of Syn III among different species. These results support that Syn III is involved in dopaminergic neurons development and provide a rationale for the interpretation of studies linking Syn III alterations to dopamine-related developmental disorders. Aim 2-Task 2: To generate the zebrafish hsa.SNCA transgenic line as a novel PD model, a Tol2 vector was designed to drive N-terminal mCherry-tagged hsa.SNCA (mChαSyn) expression under a the guidance of a modified version of the pan-neuronal promoter zHuC/elavl3. mChαSyn was efficiently expressed in neurons soma and branches. Acridine orange assay and visual-motor response tests showed that mChαSyn expression in zebrafish embryos did not exert toxic effects nor alteration of neurological function. This study represents a first step toward the generation of a novel zebrafish-based PD model.