Study of inborn errors of Coenzyme A biosynthesis using Danio rerio animal models

I modelli animali vengono utilizzati per investigare la patogenesi e i processi molecolari coinvolti nell’insorgenza di malattie umane. Danio rerio, ha assunto nell’ultimo decennio un ruolo predominante per via di alcune caratteristiche come la facilità d’utilizzo, l’elevato numero di embrioni ottenibili, la possibilità di seguire lo sviluppo embrionale e un genoma completamente sequenziato. Con il termine Neurodegenerazione con accumulo di ferro cerebrale (NBIA) si indica una famiglia di malattie, caratterizzate da un accumulo di ferro a livello cerebrale. Tutte le forme di NBIA conosciute sono indotte da mutazioni in singoli geni che codificano per proteine coinvolte in diversi processi cellulari. PKAN e CoPAN sono due di queste patologie causate rispettivamente da mutazioni dei geni PANK2 e COASY, che codificano per proteine coinvolte nella sintesi del Coenzima A. La downregolazione dei due ortologhi di zebrafish di PANK2 e CoASY, rispettivamente pank2 e coasy, ha dimostrato l’insorgenza di fenotipi paragonabili alle patologie umane suggerendo la possibilità di usare Danio rerio come modello per lo studio di PKAN e CoPAN. Lo studio è proseguito con la generazione di modelli Knock-Out per pank2 e coasy e dalla loro caratterizzazione. È stata utilizzata la tecnologia CRISPR/Cas9, che ha permesso di ottenere linee mutanti per pank2 e coasy. L’analisi di espressione genica sui KO di pank2 non ha rilevato cambiamenti significativi in geni che potrebbero sopperire alla funzione di pank2 (pank1a e pank1b), o in geni coinvolti nella sintesi del CoA (coasy). Analisi dei livelli proteici hanno dimostrato una significativa riduzione dei livelli di pank2 negli embrioni mutanti. Sulla base dei dati ottenuti in precedenza che indicavano uno sviluppo neuronale aberrante, è stata eseguita una valutazione dello sviluppo del sistema nervoso degli embrioni e del cervello di individui adulti utilizzando diverse tecniche. I risultati ottenuti dimostrano che sia negli embrioni che negli adulti mutanti non sono presenti rilevanti difetti nello sviluppo delle principali aree neuronali. L’analisi del sistema vascolare ha evidenziato un’alterazione morfologica del plesso venoso causale, risultato che conferma in parte quello visto in modelli KO per pank2 suggerendo ulteriormente l’importanza di pank2 nello sviluppo dei vasi. È stata osservata una diminuzione del numero di cellule primordiali germinali negli embrioni, difetti che probabilmente è implicato nell’atrofia testicolare osservata negli individui adulti. Questo risultato è in linea con quanto documentato nel modello murino per PKAN che è caratterizzato soprattutto per azoospermia. Un’analisi comportamentale delle larve non ha rilevato alcuna differenza, mentre lo studio della risposta indotta da stress nell’adulto ha dimostrato una diminuzione del comportamento associato a stress nei mutanti. I risultati ottenuti ci hanno permesso di dimostrare che pank2 è implicato in diversi pathways in zebrafish, nello specifico la formazione di vasi, nel corretto sviluppo di cellule germinali e nei circuiti neurali implicati nella risposta allo stress. Il secondo obiettivo della nostra analisi è stata la generazione di una linea mutante per coasy, creando un modello di CoPAN in zebrafish. La caratterizzazione di questo modello a livello fenotipo ha dimostrato che individui omozigoti per la mutazione non riesco a raggiungere lo stadio adulto ma muoiono entro il 15 giorno di sviluppo, inoltre è stata documentata l’assenza della vescia natatoria in individui mutanti a 5 giorni. Ulteriori analisi andranno effettuate per meglio comprendere i meccanismi che legano questo fenotipo alla mancanza di coasy. I risultati ottenuti evidenziano differenze rispetto ai controlli che potrebbero essere utili per comprendere i meccanismi alla base di queste patologie e/o per lo screening di potenziali target terapeutici.

Animal models are widely used to investigate the pathogenesis and molecular processes involved in the development and progression of human diseases. The Danio rerio, assumed a predominant role in the last decade due to some characteristics such as ease of use, the high number of embryos obtainable, the possibility to follow embryonic development and a completely sequenced genome. Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation (NBIA) is a family of diseases characterized by a peculiar accumulation of iron in the brain. All known forms of NBIA are induced by mutations in single genes that code for proteins involved in different pathways. PKAN and CoPAN are two neuropathologies of this group, respectively caused by mutations in PANK2 and COASY genes, which encode for proteins directly involved in the synthesis of Coenzyme A. The transient downregulation of the two zebrafish orthologues of PANK2 and CoASY, respectively pank2 and coasy, induces the onset of specific phenotypes comparable to human pathologies, suggesting the possibility of using Danio rerio as a model for the study of XXX and a tool to discover potential therapeutic strategies. The study was followed by the generation of Knock-Out models for pank2 and coasy and their subsequent characterization. CRISPR/Cas9 technology was used, which allowed us to obtain mutant lines for pank2 and coasy. Analysis performed on pank2 Knock-Out, revealed no significant changes in gene expression that could compensate the lack of pank2 (pank1a and pank1b), or in genes that could compensate the absence of the protein (coasy). However, Western Blot analysis demonstrated a significant reduction in pank2 levels in mutant embryos. Based on previously obtained data which indicated aberrant neuronal development, evaluation of the nervous system development of mutant embryos and the brains of adult individuals was performed using several techniques. The results obtained do not show significant defects in the development of the main neuronal regions both in embryos and in mutant adults. The analysis of the vascular system instead highlighted a morphological alteration at the level of the caudal venous plexus. This results partially confirms what was found in Knock-Down models, suggesting the importance of pank2 for the correct development of the vessels. Specific stains for primordial germ cells showed a decrease in this population in mutant embryos at early stages of development, defects that are probably implicated in the testicular atrophy observed in adults of 1 year of age. This result is similar to what was observed in the mouse model for PKAN which is mainly characterized by azoospermia. A preliminary analysis of the behaviour of the mutant larvae did not reveal any particular difference, while the study of the stress-induced response in adults showed a decrease in the behaviour associated with stress in the mutants. The results indicate that pank2 is involved in various pathways in zebrafish, specifically the formation of vessels, the correct development of germ cells and in the neural circuits involved in the stress response. Furthermore, we successfully generated a CoPAN model in zebrafish inducing mutations in coasy. To date, the phenotypical analysis of this model demonstrate that individuals carrying homozygotes mutation cannot reach adulthood and die before day 15 of development. We also noted the absence of swimming bladder in mutant individuals at 5 days of development. Further analyses will be carried out to better understand the mechanisms that link the onset of this phenotype and the lack of coasy. In conclusion, we generated two models one for for inborn errors of CoA biosynthesis in Danio rerio, their characterization highlights different phenotypes related to the absence of pank2 and coasy that could be useful to better understand the mechanisms underlying these pathologies and can be used to screen molecules with therapeutic potential.