identificazione e caratterizzazione di una nuova miopatia vacuolare causata da una mutazione nel gene PLIN4 e possibili strategie per lo sviluppo di una terapia

In a family affected by distal vacuolar myopathy we performed genome exome and RNAseq, failing to identify probably pathogenic coding variants. At the same time, a patient with a recombination underwent a muscle biopsy in which an immunohistochemical analysis showed an increased signal at the subsarcolemmal level and within the vacuoles, of two proteins linked to the degradation of the misfolded and aggregated proteins, p62 / SQSTM1 and ubiqutinated proteins (FK2). The same analysis on patients with increasing severity of the phenotype showed a correlation with the intensity of these proteins’ signals. Therefore, we hypothesized that the protein that was labeled so specifically must be our mutated protein. We then performed a laser microdissection of the vacuoles with mass spectrometry analysis, thus highlighting that the protein accumulated in the vacuoles and encoded by the PLIN4 gene present on the common haplotype, was perilipin 4. From the re-analysis of the NGS data we identified a coverage peak compatible with a possible repetition of the sequence. Long-read sequencing using Oxford Nanopore Technology identified an expansion of 9x99 nucleotides in the exon 3 region, encoding the amphipathic domain of perilipin-4, a region structurally related to the amphipathic helices present in α-synuclein and apolipoproteins. The immunohistochemical analysis focused on the aggreaphagy pathway confirmed that the accumulation of perilipin-4 in the muscle is associated with the activation of this pathway, mediated by the ubiquitination of the aggregates and responsible for eliminating them through autophagy. This new pathology is therefore an aggregate accumulation disease, caused by an expansion of a region of the protein with the apparent inability of the aggrephagy itself to control its accumulation. The study of the molecular mechanism at the cellular level was not possible in myoblasts derived from patient biopsies, as this protein does not appear to be expressed at this level. Therefore, we decided to generate an overexpression model in which the mutated and wild-type proteins will be compared to validate the propensity of the mutated variant to cause aggregate precipitation.

In una famiglia affetta da miopatia vacuolare distale abbiamo effettuato esoma genoma e RNAseq non riuscendo ad individuare varianti codificanti verosimilmente patogeniche. Contemporaneamente, una paziente con una ricombinazione si è sottoposta a biopsia muscolare nella quale un’analisi immunistochimica ha mostrato un aumentato segnale a livello subsarcolemmale e all’interno dei vacuoli, di due proteine legate alla degradazione delle proteine misfolded e aggregate, p62/SQSTM1 e le proteine ubiqutinate (FK2). La stessa analisi su pazienti con severità del fenotipo media o grave, ha mostrato una correlazione con l’intensità di queste marcature. Pertanto abbiamo ipotizzato che la proteina che veniva marcata in maniera così specifica dovesse essere la nostra proteina mutata. Abbiamo quindi effettuato una microdissezione laser dei vacuoli con analisi di spettrometria di massa, evidenziando così che la proteina accumulata nei vacuoli e codificata dal gene PLIN4 presente sull’aplotipo comune, era perilipina 4. Dalla rianalisi dei dati di NGS abbiamo individuato un picco di coverage compatibile con una possibile ripetizione della sequenza. Un sequenziamento long-read usando la tecnologia Oxford Nanopore Technology, ha identificato una espansione di 9x99 nucleotidi nella regione dell’esone 3, codificante per il dominio anfipatico di perilipina-4, regione strutturalmente correlata alle eliche anfipatiche presenti in α-sinucleina e nelle apolipoproteine. L’analisi immunoistochimica focalizzata sul pathway dell’aggreafgia, ha confermato che l’accumulo di perilipina-4 nel muscolo è associato all’attivazione di questo pathway, mediato dall’ubiquitinazione degli aggregati e deputato all’eliminazione degli stessi tramite autofagia. Questa nuova patologia è quindi una malattia da accumulo di aggregati, causata da una espansione di una regione della proteina con apparente incapacità dell’aggrefagia stessa di controllarne l’accumulo. Lo studio del meccanismo molecolare a livello cellulare, non è stato possibile nei mioblasti derivati da biopsie dei pazienti, in quanto questa proteina non risulta essere espressa a questo livello. Pertanto, abbiamo deciso di generare un modello di overespressione nel quale la proteina mutata e quella wild-type verranno confrontate per validare la propensità della variante mutata a causare precipitazione di aggregati.