The atypical receptor CCRL2 as a modulator of aged neutrophil homing to clearance organs

Advance light microscopy techniques indicate that chemokine receptors can form both homo- and heterodimers with other receptors, adding layers of complexity in the modulation of cell responses. In 2017, our research group demonstrated the functional role of heterodimerization occurring between the conventional chemokine receptor CXCR2 and CCRL2. CCRL2 is a 7-transmembran domain receptor that shares structural similarities with atypical chemokine receptors family, even if it does not bind a chemokine but a chemotactic protein called chemerin and it does not act as an internalization and scavenger mediator. Through heterodimerization with CXCR2, CCRL2 can affect CXCR2 signaling, which plays a pivotal role in neutrophil CXCL8-dependent recruitment. With the purpose of finding further possible heterodimerization between CCRL2 and other chemokine receptors, this thesis demonstrates that CCRL2 can form heterodimers also with CXCR4, the receptor, together with CXCR2, that principally regulate neutrophil migration during their life-span and clearance. Briefly, CXCR4-CXCL12 axis plays a fundamental role in the release and homing of neutrophils from and to bone marrow, while CXCR2 is involved in neutrophil recruitment into the inflammatory sites. The main aim of the study was to investigate the biological relevance of CCRL2 heterodimerization with CXCR4 during aged neutrophil clearance. The data were obtained by in vitro murine neutrophils phenotypic and functional characterization by flow cytometry, in vivo neutrophil stimulation and adoptive transfer experiments taking advantages from selective or not selective inhibitors of CXCR4 and CXCR2. In particular, we demonstrated that CCRL2 can negatively affect CXCL12-dependent CXCR4 signaling both in vitro and in vivo, by diminishing RhoA activation, ERK1/2 phosphorylation, actin polymerization and, functionally speaking, also the homing of aged neutrophils to bone marrow. On the other hand, adoptive transfer experiments showed that CCRL2 can affect CXCR2 signaling not only, as already demonstrated, during neutrophil recruitment in inflammatory conditions, but also during aged neutrophil clearance to the liver. The use of selective or not selective inhibitors in adoptive transfer experiments, as Pertussis Toxin and Repertaxin, allowed to discriminate the different pathways CXCR4 or CXCR2 dependent. However, CCRL2 doesn’t seem to play a role in the efferocytosis of aged neutrophils by tissue macrophages. Assuming the pro-inflammatory relevance of senescent neutrophils in pathologic condition, CCRL2 can be considered a fine-tuning modulator of neutrophil migratory processes and, translationally, a possible target to affect them. Thus, our results can be considered as a starting point to further better define the role of aged neutrophils in different pathological conditions, such as inflammatory-dependent liver diseases and tumor processes.

Tecniche avanzate di microscopia hanno permesso di dimostrare come i recettori delle chemochine possano essere organizzati sulla membrana cellulare in omodomeri e/o eterodimeri, implementando la complessità di modulazione delle risposte cellulari. Nel 2017 il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato il ruolo funzionale dell’eterodimerizzazione fra il recettore convenzionale per chemochine CXCR2 e il recettore atipico CCRL2. CCRL2 è un recettore a sette domini transmembrana che condivide similarità strutturali con la famiglia dei recettori atipici per chemochine, anche se, tuttavia, non lega una chemochina ma una proteina chemotattica chiamata chemerina e non funge da mediatore di internalizzazione e riciclo del ligando. Quando è espresso insieme a CXCR2, CCRL2 può formare eterodimeri CCRL2-CXCR2, influenzando il signaling di CXCR2 che è cruciale per regolare il reclutamento dei neutrofili in risposta a CXCL8. Con l’obiettivo di individuare ulteriori possibili forme di interazione fra CCRL2 e altri recettori per chemochine, questa tesi dimostra come CCRL2 possa formare eterodimeri anche con altri recettori a 7 domini transmembrana, come CXCR4, un recettore per chemochine che, insieme con CXCR2, regola la migrazione dei neutrofili durante il loro ciclo vitale e la loro clearance. Infatti, l’asse CXCR4-CXCL12 gioca un ruolo fondamentale durante il rilascio e il ritorno dei neutrofili rispettivamente da e verso il midollo osseo, mentre CXCR2 è coinvolto nel reclutamento dei neutrofili nel sito infiammatorio. Lo scopo principale di questo lavoro è quello di identificare la rilevanza biologica dell’eterodimerizzazione fra CCRL2 e CXCR4 durante la clearance di neutrofili senescenti. I dati sono stati prodotti tramite esperimenti di caratterizzazione fenotipica e funzionale di neutrofili murini in vitro, stimolazione pro-infiammatoria di neutrofili endogeni in vivo e esperimenti di adoptive transfer sfruttando inibitori selettivi o non selettivi di CXCR4 e CXCR2. I risultati ottenuti mostrano come CCRL2, in una condizione di possibile eterodimerizzazione con CXCR4, sia in grado, a seguito del legame con CXCL12, di modularne negativamente il signaling intracellulare sia in vitro che in vivo, diminuendo l’attivazione di RhoA, la fosforilazione di ERK1/2, la polimerizzazione dell’actina e, funzionalmente, anche il ritorno dei neutrofili senescenti al midollo osseo. Gli esperimenti di adoptive transfer hanno inoltre mostrato come CCRL2 possa influenzare il signaling di CXCR2 anche nel processo di clearance al fegato e non solo nel reclutamento al sito infiammatorio come già dimostrato. L’utilizzo di inibitori 6 selettivi (Repertaxin) e non selettivi (Pertussis Toxin) di CXCR4 e CXCR2, ha ulteriormente permesso di discriminare, quali, fra i processi osservati, fosse CXCR4- o CXCR2-dipendente. Invece, CCRL2 non sembra essere coinvolto nel processo di efferocitosi, ovvero di fagocitosi dei neutrofili senescenti da parte dei macrofagi tissutali. Partendo dal presupposto che i neutrofili senescenti rappresentano un subset di rilievo in alcune condizioni patologiche di stampo cronico-infiammatorio, CCRL2, alla luce di questi dati, potrebbe quindi essere considerato come un fine modulatore della loro migrazione e, in un’ottica traslazionale, potrebbe rappresentare un futuro target terapeutico per modificarla. I nostri risultati possono quindi essere considerati come un punto di partenza per poter meglio definire il possibile coinvolgimento di CCRL2 nel reclutamento di neutrofili senescenti in diverse condizioni patologiche come, ad esempio, in patologie infiammatorie croniche del fegato o nei tumori.